陈肖,王立坤,刘卫东,左志文

(1.徐州医科大学药学院,江苏徐州221004;2.徐州医科大学附属临沂医院,a.感控中心病区;b.药学部;c.感控管理部,山东临沂276000)

1991年国际共识小组将脓毒症定义为对感染的全身炎症反应,指出脓毒症可能是对多种感染原因的反应[1]。2016年美国重症医学会(SCCM)联合欧洲重症医学会(ESICM)共同修订新版脓毒症定义:因感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[2-4]。脓毒症以感染引起的全身炎症反应综合征为主要临床特点[1],具有高病发率和致死率,疾病进展迅速,2017年脓毒症相关死亡数占全球死亡总数的19.7%[5]。使用抗菌药物控制感染源、机械辅助治疗恢复器官功能是治疗的主要环节[6]。多黏菌素B 破坏细胞外膜引起细菌死亡,CHINET 数据保持不动杆菌属低耐药率[7-8]。鲍曼不动杆菌近年在院内暴发流行,易造成院内危重病人等免疫力低下人群的感染,社区获得性感染和医疗保健相关感染都会导致严重的脓毒症,肺炎是最常见的原因,其次是腹腔内和泌尿道感染[9-10]。

TAK-242是特异性TLR4抑制剂,下调TLR4下游信号分子的表达,抑制NO,TNF-α和IL-6的产生[11-13]。有研究证明TAK-242可以作为潜在的脓毒血症治疗药物,并在人体中安全有效[14]。多黏菌素B是一种环形阳离子多肽,Tsuzukit等报道多黏菌素B的治疗作用可能与降低TNF-α、IL-6 有关,一方面是由于多黏菌素B 对LPS的中和作用;另一方面也可能与其对LPS活化的信号转导通路NF-κB的下调有关[15-20]。

近年来该菌在院内广泛流行,多黏菌素B 是治疗广泛耐药鲍曼不动杆菌感染的一线用药,除了直接抗菌作用,还化学计量地与细菌脂多糖的脂质A部分结合,也可通过囊泡接触途径,使得细胞内外膜之间的成分交叉,导致细菌膨胀、溶解[21-23]。Toll样受体(TLRs)是微生物组分的重要模式识别受体[24],参与机体的固有免疫和适应性免疫,TLRs信号途径能通过依赖和非依赖性My D88两条传导途径激活NF-κB调控炎症因子基因转录,刺激大量内源性因子释放引起细胞级联反应,脓毒症中存在TLRs信号途径的异常活化[25],说明TLRs通路在脓毒症中参与炎症进程,诱导促炎细胞因子分泌[26-29]。

本研究用鲍曼不动杆菌腹腔注射建立脓毒症大鼠模型,以TLR4/NF-κB/IL-6 等炎症通路为切入点,通过多黏菌素B、TAK-242干扰LPS-TLR4结合探究多黏菌素B 和TLR4抑制剂对脓毒症的影响及机制。

1 实验部分

1.1 原料与仪器

鲍曼不动杆菌(ATCC19606 标准菌株),北京浦然进出口有限公司。8 周龄SPF 级雄性Wister大鼠,体重250～280 g,许可证号:SCXK(京)2019—0010,斯贝福生物技术有限公司;多黏菌素B(国药准字H31022631,每瓶50 mg),上海上药第一生化药业有限公司;TAK-242,美国Med Chem Express公司。

Rat PCT ELISA 试剂盒、Rat CRP ELISA 试剂盒、Rat TNF-αELISA 试剂盒,武汉华美生物公司;Rat IL-6 ELISA 试剂盒,上海生工生物工程股份有限公司;RNA 提取试剂盒,上海依科赛公司;逆转录和qPCR 试剂盒,沃卡威(北京)生物技术有限公 司;兔 抗 NF-κB P65、兔 抗 p-NF-κB P65(ser536),美 国Cell Signaling Technology 公 司;HRP标记山羊抗鼠/兔二抗、内参beta-actin,武汉三鹰公司;引物由上海生工生物设计合成。

细菌培养箱,SHZ-82 型,常州智博瑞仪器;血液分析仪,ADVIA 2120i型,德国西门子公司;酶标仪,Thermo Multiskan FC 型,美国赛默飞世尔公司;荧光定量PCR 仪,罗氏480II型,罗氏诊断产品(上海)有限公司;PCR 仪,依科赛IT041-0002 型,依科赛生物科技太仓有限公司;图像拍摄仪器,SAGE CREATION mini chemi型,岑祥股份有限公司;显微镜和成像系统,日本尼康公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌液浓度确定和脓毒血症模型的建立

测波长600 nm的OD 值,取4组菌液浓度分别为,5×108,1×109,1×1010,2×1010CFU·m L－1,大鼠适应性饲养一周后,每组10只,予以不同浓度的细菌溶液10 mL·kg－1腹腔注射,对照组以相同方法注射无菌生理盐水,大鼠饲养环境12 h光暗交替,自由饮食饮水,观察大鼠一周生存率及精神状态等,选绝对致死剂量为最终浓度后,以菌悬液10 mL·kg－1腹腔注射造模。

1.2.2 分组与给药

选定最终浓度后取50只雄性Wistar大鼠适应性饲养1周后随机分为以下5组,每组10只,分别为空白对照组(C组),腹腔注射无菌生理盐水;模型对照组(M 组),腹腔注射鲍曼不动杆菌;模型＋多黏菌素B组(PB组),注射菌液30 min后尾静脉注射3 mg·kg－1多黏菌素B;模型＋TAK-242 组(TAK 组),注射菌液30 min后尾静脉注射3 mg·kg－1TAK-242;模型＋多黏菌素B＋TAK-242 组(PB＋TAK 组),注射菌液30 min后尾静脉注射多黏菌素B和TAK-242,两药间隔10 min。

1.2.3 一般观察

5组大鼠按分组注射液体后0、2、4、6、8、10、12 h检测肛温,观察大鼠呼吸频率、精神状态、行为活动和有无腹泻等,开腹后观察腹腔脏器等一般情况。

1.2.4 血液指标

1)注射菌液12 h后取各组大鼠,水合氯醛过量麻醉。麻醉后暴露腹腔,用一次性采血针进行腹主动脉取血。EDTA 抗凝管采血1 mL左右进行血常规检测。

2)取大鼠新鲜抗凝全血,用两倍体积的PBS稀释全血充分混匀。吸取100μL 血液均匀涂在血平皿中,将培养皿置于培养箱中37℃培养过夜。培养24 h后将培养皿取出进行拍照和克隆计数。

3)留取足量血清,拿出试剂盒恢复室温后将标准品梯度稀释,每个反应孔中加入100μL标准品和样本液,37 ℃孵育1.5～2 h后弃液甩干,加入100 μL生物素标记抗体工作液,37 ℃孵育1 h后弃液洗板,再加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL,孵育后洗板,加入90μL 底物溶液,避光显色15～30 min,最后加入50μL 终止液,于450 nm处读取OD 值。绘制标准曲线,计算各孔样品CRP、PCT、IL-6、TNF-α的浓度。

1.2.5 组织病理(HE染色)

动物分组同上,每组随机选3 只,取新鲜组织肺、肝、肾、脾、肠固定于4%多聚甲醛24 h以上,梯度乙醇脱水:75%乙醇4 h—85%乙醇2 h—90%乙醇2 h—95%乙醇1 h—无水乙醇I 30 min—无水乙醇Ⅱ30 min—醇苯5～10 min—二甲苯I 5～10 min—二甲苯Ⅱ5～10 min—蜡I 1 h—蜡Ⅱ1 h—蜡Ⅲ1 h。石蜡包埋后切片,片厚4μm,进行苏木素-伊红染色,显微镜镜检。

1.2.6 用RT-PCR 检测PBMC中TLR4受体m RNA的表达情况

动物分组同上,每组大鼠取1 mL 新鲜抗凝全血,用等体积的PBS稀释全血上下颠倒混匀,在离心管中加入3 mL Ficoll分离液,将稀释后的血液平铺到分离液液面上方,3 000 r·min－1离心,离心25 min。离心后吸取白膜层细胞到15 mL洁净的离心管中,10 mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250 g,离心10 min。重复2次弃上清,用5 mL的PBS重悬细胞,1 500 r·min－1离心10 min后,弃上清,将分离的外周血单个核细胞(PBMC)－80℃保存。

PBMC解冻后Trizol法提RNA,按照试剂盒说明书加入反应体系进行操作,以β-actin为内参,用2－△CT表示5组大鼠PBMC 中TLR-4的m RNA相对表达量,扩增条件:95 ℃,预变性10 min,开始40个循环:95 ℃20 s、58 ℃30 s、72 ℃20 s;然后95℃1 min、58℃30 s、95℃30 s终止反应。每组样本重复3 次,取平均值。β-actin基因引物F:5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,R:5′-AGGAAGAGGATGCGGCAGTGG-3′;TLR4 F:5′-TTGCTGCCAACATCATCCAGGAAG-3′,R:5′-CAGAGCGGCTACTCAGAAACTGC-3′。

1.2.7 用Western Blot检测PBMC中NF-κB蛋白及s536位点磷酸化蛋白的表达情况

分离PBMC 同上,取50μg 组织进行液氮研磨,加入适量裂解液和PMSF,在冰上进行超声破碎,4 ℃离心取上清,用BCA 法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)转膜,转膜结束后,TBST 洗涤3次,每次1 min。封闭后一抗孵育4 ℃过夜,TBST 洗涤5次,每次10 min。二抗25℃孵育1 h。TBST 洗涤5次,每次10 min。用ECL发光显示剂曝光显影,图像拍摄仪器扫描分析,计算NF-κBp65和p-NF-κBp65的相对表达量,用目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

1.2.8 统计学处理

用SPSS25.0 软件分析结果,以Graph Pad Prism 8作图,计量资料符合正态分布用均数±标准差(±s)表示,多组间比较用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义,每组重复3次。

2 结果与讨论

2.1 浓度菌液选择

实验研究2004年出现第一例予以小鼠腹腔注射鲍曼不动杆菌建立脓毒血症[30],通常研究大鼠或小鼠肺部气管喷入107～109CFU·m L－1细菌菌液建立肺源性脓毒症模型[31],腹腔注射大肠杆菌[32]、或临床分离出的Ab、或静脉内注射[33-34],但不同细菌不同造模方法对实验对象的绝对致死剂量不一致,不同菌株的毒力致病性也不尽相同。鲍曼不动杆菌本身属于条件致病菌,若机体免疫功能正常而且细菌繁殖没有达到一定的数量级,机体能识别并清除该菌,不会造成严重感染。

为了选择合适的造模浓度,本次实验设定4组鲍曼不动杆菌标准菌株菌液浓度,均予以10 mg·kg－1腹腔注射,前两组大鼠一周内生存数没有变化;2×1010CFU·m L－1组大鼠注射该剂量鲍曼不动杆菌后在24 h内一组完全死亡,说明大剂量细菌腹腔注射造成急性感染,侵袭腹腔脏器且进展快速;1×1010CFU·m L－1的浓度菌液使大鼠在24 h内死亡60%,48 h内死亡100%,提示不同个体对鲍曼菌株抵抗力有差异,后两组病情进展状况更符合脓毒症进展迅速、致死率高的特点,为了利于大鼠感染后取材,最终选1×1010CFU·m L－1为造模浓度进行后续实验。

2.2 大鼠一般特征分析

对照组和实验组共分为5组,模型组大鼠注射鲍曼不动杆菌6 h后出现呼吸急促、扎堆、精神状态差不愿活动,个别大鼠出现腹泻。大鼠肛温检测发现,大鼠在注菌后2 h大部分出现肛温升高,4 h和6 h肛温持续下降,6 h后趋于稳定。空白对照组和实验组6 h后肛温差异有统计学意义,例如空白对照组(C组)和实验对照组(M 组)比较,6、8、10、12 h,有差异(F＝10.4～13.63,P＜0.01),同一组内4、6、8、10、12 h体温和0 h体温比较,差异有统计学意义,见图1。

图1 各组大鼠不同时间点肛温的比较(n＝10,±s)Fig.1 Comparison of anal temperature at different time points in each group(n＝10,±s)

2.3 各组大鼠血液指标的比较

5组组间比较有显著性差异(F＝267.76,P＜0.01),实验组和C组比较,实验组细菌计数水平明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.01),PB组、TAK组、PB＋TAK 组和M 组比较差异有统计学意义,PB组和TAK 组、TAK 组和PB＋TAK 组比较组间差异均有明显统计学意义(P＜0.01),见图2。

图2 各组大鼠全血细菌计数的结果比较(n＝10,)Fig.2 Comparison of bacteria counts in the whole blood of rats in each group(n＝10,)

实验组和空白对照组比较,白细胞计数(WBC)、中性粒细胞比率(NEU%)、淋巴细胞比率(LYM%)、血小板计数(PLT)均有统计学意义(F＝29.86、29.59、24.86、141.83,P＜0.01)。PB 组、TAK 组、PB＋TAK 组与M 组比较均有统计学意义(P＜0.05)。NEU%和LYM%指标实验用药3组间比较TAK组和PB＋TAK组有差异,PLT 3组间两两比较均有统计学意义(P＜0.05),见图3。

图3 造模加药对各组大鼠血细胞的影响(n＝10,±s)Fig.3 Effects of modeling and drug addition on blood cells in each group(n＝10,±s)

造模加药对大鼠炎症因子的影响(n＝10,±s)见图4。C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)指标5 组间比较有显著性差异(F＝52.78、12.55、72.20、36.54,P＜0.01),实验组和对照组比较,均有统计学意义(均P＜0.01),用药3 组和模型组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.01),CRP、IL-6指标PB组和PB＋TAK 组、TAK组和PB＋TAK 组比较有差异,TNF-α指标PB 组和PB＋TAK 组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),4个炎症因子PB组和TAK 组间均没有差异(P＞0.05)。

图4 造模加药对大鼠炎症因子的影响(n＝10,±s)Fig.4 Effect of modeling and drug addition on inflammatory factors in rats(n＝10,±s)

以上结果显示白细胞、中性粒细胞等和ELISA 检测炎症因子均有差异,模型组全血细菌计数达到(300.50±27.60)CFU·(100 mL)－1,空白对照组阴性,说明腹腔注射鲍曼不动杆菌后大鼠存在菌血症,通过腹腔造成血流感染继而建立全身感染模型是可行的,为研究鲍曼不动杆菌脓毒症提供实验基础。

2.4 各组大鼠组织病理学的比较

造模加药对老鼠组织的影响见图5。经HE 染色可见C组肺肝肾脾肠组织结构正常;M 组肺气管周围可见炎细胞浸润,部分肺泡壁增厚,肝细胞水肿变性,肾小管变性萎缩坏死,脾脏红髓增生;PB组可见干细胞坏死,部分肾小管变性萎缩坏死,脾脏红髓增生;TAK组与PB＋TAK组大量肾小管细胞、脾脏细胞坏死。

图5 造模加药对大鼠组织的影响Fig.5 Effect of model making and drug addition on rat tissue

2.5 各组大鼠外周血单个核细胞TLR4/NF-κB 表达水平的比较

单因素方差分析结果显示,5组大鼠PBMC 中TLR4 mRNA的表达水平均具有显著性差异(F＝27.58,P＜0.01),TLR4抑制剂TAK 组的mRNA 表达水平最低;C组和其他四组间比较有差异,M 组和用药3组间均有差异,PB组和TAK 组、TAK 组PB＋TAK 组比较均有统计学意义(P＜0.05),见图6。

图6 造模加药对PBMC中TLR4 mRNA的影响(n＝10,±s)Fig.6 Effect of modeling and dosing on TLR4 m RNA in PBMC(n＝10,±s)

单因素方差分析结果见图7。结果显示,5组大鼠PBMC 中NF-κBp65和s536位点磷酸化NFκBp65表达水平均具有显著性差异(F＝34.32、61.59,P＜0.01),两两比较除PB 组和TAK 组的NF-κBp65表达没有差异(P＞0.05),TAK 组和PB＋TAK 组的p-NF-κBp65表达没有明显差异(P＞0.05),其余两两比较NF-κBp65及s536位点p-NFκBp65表达差异均有统计学意义(P＜0.05),见图7。

图7 各组大鼠NF-κBp65和p-NF-κBp65蛋白的相对表达量(n＝10,±s)Fig.7 Relative expression of NF-κBp65 and p-NF-κBp65 protein in rats of each group(n＝10,±s)

3 结语

通过TAK-242特异性抑制TLR4介导的信号转导,探讨多黏菌素B 单用和联用对TLR4/NF-κB炎症通路的干预机制,结果显示单用多黏菌素B 可以通过下调TLR4 m RNA 和下游蛋白NF-κB、降低炎症因子IL-6、TNF-α、CRP、PCT 等炎症因子表达,联用效果优于单用。以上结果提示TLR4/NFκB炎症通路参与鲍曼不动杆菌脓毒症发病过程,多黏菌素B有效清除细菌,治疗脓毒症潜在机制是可能通过TLR4/NF-κB 信号通路减轻鲍曼不动杆菌感染大鼠的炎症,并能在脓毒症早期减轻炎症反应过度激活状态,避免影响机体正常免疫功能,后续可收集临床样本进一步探讨临床意义和实用价值。