曾艳华，龙蔷宇，何荆洲，李秀玲，范继征，卜朝阳

(广西农业科学院花卉研究所，广西 南宁 530007)

国兰在我国已有一千多年栽培历史，以其清幽、飘逸、高雅的风姿深受国人喜爱。但国兰育种周期长、繁育速度慢，一直是其实现产业化的瓶颈。诱导国兰在瓶内开花能大幅缩短开花所需时间(从几年缩至几个月)，例如日本大花蕙兰(Cymbidium hybridum)常规培育的开花时间是4～7年，诱导离体培养开花只需 3个月[1]。因此，通过体外花诱导可在6个月内早期评估花色，不仅缩短了评估所需时间(至少2年)，而且降低劳动力成本，优化传统兰花育种所需空间，对兰花育种非常有利。近年来，国内在槭叶茑萝(Ipomoea×sloteri)、铁皮石斛(Dendrobium officinale)、龙葵(Solanum nigrum)等 41个植物品种上实现试管苗开花[2—3]，其中包括兰属的建兰[4—6]、春兰[7—8]、寒兰[9]、春兰×大花蕙兰[10]、春剑×大花蕙兰[11]、大花蕙兰[1]等品种。这为试管苗开花机理研究提供了良好的证据，也充分说明植物试管苗开花具有一定的普遍性。但如此多的品种，其诱导开花机理仍在探索中。

植物开花是极其复杂的生物学过程，受诸多因子调控[12]，其中碳水化合物和蛋白质作为能量物质和结构物质在花芽分化过程中起着重要作用。本研究采用春兰杂交品种试管苗为材料，通过试管开花条件摸索与优化的过程，研究与探讨诱导花芽形成及正常开花的植株生理生化变化，分析可溶性蛋白质、可溶性总糖及参与代谢的酶类物质与花芽分化间的关系，为建立国兰试管开花体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 试管开花诱导

以广西农业科学院花卉研究所花卉种苗组培快繁中心培养的春兰ב寒香梅’(Cymbidium goeringii×C.‘Han Xiang Mei’)无菌瓶苗为试材，‘寒香梅’为春兰集圆×越南四季兰(C.‘JiYuan’ ×C .ensifolium)杂交种。选取高约3 cm健康瓶苗进行开花诱导培养。试验分生长调节剂水平、无机盐水平和对照3组处理(表 1)，基础培养基中附加琼脂 4 g·L-1、蔗糖 20 g·L-1、椰汁 100 mL·L-1；无机盐水平培养基中添加2.0 mg·L-16-BA，pH 5.6～5.8(表 1)。经试验筛选出最佳生长调节剂浓度配比和最佳 P、K含量组合，对花芽诱导率较高的综合处理和对照试管苗作生理生化分析。其中综合处理组的培养基配方为MS(3P,3K)+TDZ 0.2 mg·L-1+椰汁 100 mL·L-1+琼脂 4 g·L-1+蔗糖20 g·L-1，对照组培养基为MS附加琼脂和蔗糖。试验组每瓶5株苗，每处理设50株，重复3次。培养温度(25±2) ℃，光照强度 2000 lx，光照时间 8 h·d-1。观察记录试管苗生长情况。

表1 试管开花诱导培养基配方Table 1 Medium used as in vitro flowering induction

1.2 生理生化指标和激素含量检测

选取花芽诱导率较高的综合处理和对照组试管苗，在培养 0、30、40、50、60、80 d时分别取整株(不包含原外植体茎段)测定蛋白质、可溶性总糖含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。选用苏州科铭生物技术有限公司生产的相关试剂盒进行检测，其中蛋白质使用BCA法测定，SOD活性采用NBT法测定。每处理重复3次。

选取花芽诱导率较高的综合处理和对照组试管苗在培养0、20、40、60、80 d时分别取整株苗测定内源激素吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)，每处理3次重复。IAA和ABA检测采用液质联用法，色谱柱：C18 柱(2.1 mm × 100 mm，1.9 μm)；色谱分离条件：柱温 25 ℃，流动相 A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流速0.3 mL·min-1，进样量2 μL；质谱条件采用电喷雾电离源(ESI)正、负离子模式，多重反应监测模式(MRM模式)。

1.3 统计指标与数据分析

花芽诱导率/%=分化花芽的植株数/供试植株数×100%；

利用 SPSS 22软件进行单因素方差分析(ANOVA)，处理间的差异性多重比较采用LSD分析；采用Origin 7.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 杂交春兰试管开花诱导

2.1.1 两种生长调节剂不同浓度配比对花芽诱导的影响

在接种后第40天开始观察，直到第80天，统计花芽总数和发育状况。不同浓度6-BA和TDZ的花芽诱导率见表2。其中，使用5号和3号培养基，即添加0.2 mg·L-1TDZ或2.0 mg·L-16-BA的 MS培养基花芽诱导率最高，两者差异不显著，花芽能正常发育成花苞，但不能正常开花(图1: B, C)。4号和6号培养基的花芽诱导率较高，但发育畸形，顶端发育多头花芽(图1: D)。2号培养基(1.5 mg·L-16-BA)诱导花芽花梗较长，从营养叶中抽出，之后能正常发育开花，其萼片、捧瓣的形状、色泽接近温室培养的正常花部性状(图1: A, E)，但诱导率极低 。1号培养基和CK1未能诱导出花芽，但CK1诱导出较多的根(图1: F)。

表2 不同激素浓度配比对花芽诱导的影响Table 2 Effects of different hormone concentrations on flower bud induction

图1 添加不同浓度生长调节剂的培养基花芽诱导情况Fig. 1 Flower bud induction in different hormone concentration medium

2.1.2 不同P、K含量培养基对花芽诱导的影响

在接种后第40天至第80天统计花芽总数和发育状况。不同P、K含量培养基花芽诱导率见表3。其中，8号和9号培养基，即3P/3K和3P/5K培养基诱导花芽数量最多，两者之间差异不显著，与 7号培养基诱导率差异极显著，花芽均能正常发育，但未能正常开花，花苞在接种80 d后逐渐变黄枯萎，诱导效果与3号、5号培养基类似。CK2植株生长缓慢，能诱导少量花芽和根。

表3 不同P、K含量对花芽诱导的影响Table 3 Effects of different P, K content on flower bud induction

2.1.3 综合处理的花芽诱导率

综合上述花芽诱导率较高的处理因素，设计对照组和综合处理组实验。接种后，第20天开始，每隔20 d统计一次花芽诱导率(表4)。结果表明，在接种后，对照组未能成功分化花芽，诱导率为 0，而综合处理组在第40天时开始形成花芽，花芽诱导率为10%左右；第60天增至22%，第80天诱导率达最高，为34%左右。同时，与上述培养基第80天的诱导率相比，综合处理组的花芽诱导率极显著增高。

表4 综合处理对花芽诱导的影响Table 4 Effect of comprehensive treatment on flower bud induction

此外，在实验中观察发现，虽然综合处理组的花芽诱导比对照组时间短，诱导率高，但植株长势较差，综合处理组的部分嫩芽、新叶呈紫红色或苍白，而对照组植株长势较好且健壮，叶片较大且更绿，能舒展开来。

2.2 花芽诱导过程中生理生化变化

2.2.1 蛋白质、可溶性总糖含量与超氧化物歧化酶活性分析

在花芽诱导20 d、40 d、60 d、80 d、100 d时测定可溶性蛋白质、可溶性总糖、超氧化物歧化酶三种生理指标。由图2可见，综合处理组和对照组三个指标整体上均呈先上升后下降的趋势，且基本在60 d时达峰值，并显著高于对照组。对比各时期花芽诱导率来看，40～60 d是诱导率增加最快的时段，60～80 d花芽诱导数量仍有增加，但增速放缓。说明可溶性蛋白、可溶性总糖含量及SOD活性与花芽诱导有一定的正相关。多数花苞后期不能正常开放，以致枯萎发黄，可能与后期生理指标持续下降有关。

图2 花芽诱导过程中生理生化指标变化Fig. 2 Changes of physiological and biochemical indexes during flower bud induction

2.2.2 IAA和ABA激素含量分析

花芽诱导过程中吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)激素含量变化见图 3。在花芽诱导第 20、40、60、80天测定内源IAA和ABA含量，综合处理组IAA含量在40 d之前有一个缓慢下降的过程，40 d后逐渐升高，此后其含量均显著高于对照组。而对照组IAA在诱导20 d时达峰值，40 d时高于处理组，40天后降至综合处理组之下。综合处理组在培养40 d时诱导出花芽，而对照组在40 d后也未见花芽，说明该时期之前IAA含量过高或对花芽诱导有抑制作用。此后综合处理组花芽诱导率与IAA含量成正比。

图3 花芽诱导过程中内源激素含量变化Fig. 3 Changes of endogenous hormone content during flower bud induction

综合处理组花芽诱导过程中内源 ABA含量变化不大，第80天的含量跟最初的含量基本持平。而对照组在第40天时达低谷值，40 d后急剧升高，60～80 d显著高于处理组。说明稳定的ABA含量对花芽分化具有一定的积极作用。

3 讨论

兰花开花是一个高度复杂而综合的生物学过程，受到植株成熟度、内源激素和营养物质等因素的影响[1—2,13—14]。本研究采用一定浓度配比的 6-BA 和TDZ培养基，可以诱导试管苗形成花芽；3P/3K和3P/5K的培养基诱导花芽数量最多，且花芽均能正常发育成花苞，但未能正常开花。可见，通过调节培养基合适生长调节剂浓度配比和P/K含量能有效诱导试管花芽，但不一定能让花芽正常开花，花芽正常发育成花蕾并正常开花的数量非常少，这一过程中致畸率和败育率较高，与张新平等[13]的研究结果相一致。本研究中花芽不能正常开放的原因可能与温度有关。有研究表明，春化也是植物试管苗开花诱导的途径之一。通过模拟自然界植物春化作用，能使试管苗成功开花，有效提高开花率[16—17]。通常，自然条件下春兰的正常开花需要温度在0～12 ℃，持续时间不少于1个月的春化过程。本研究中春兰ב寒香梅’的花苞不能正常开放是否与春化作用有关还需进一步验证。

关于国兰试管苗诱导开花的生理生化研究较少。本研究表明，在春兰ב寒香梅’试管苗开花诱导培养中，试管苗的生理生化指标随着培养时间的变化发生相应变化。花芽诱导率高的处理较对照处理(花芽诱导率为 0)的可溶性蛋白质、可溶性糖含量和SOD活性整体上偏高，内源激素IAA含量在花芽成功诱导出来时出现低谷，随后花芽诱导率随着 IAA含量上升而升高。ABA含量在0～20 d有个急剧上升，之后在花芽诱导的过程中缓慢下降，第80天的含量跟最初的含量基本持平，整体变化不大。进一步说明花芽诱导期间蛋白质和碳水化合物积累可促进成花，内源ABA含量稳定和IAA含量增加利于成花[18—20]。

由此可见，植物生长调节剂和营养成分中P、K含量对试管花诱导有重要作用，不过更多研究表明，光照、春化作用等环境信号是影响多数兰花开花启动和发育的重要因素[21—22]，试管苗开花与之相关的研究较少。

4 结论

本研究确立了春兰ב寒香梅’试管花诱导的适宜培养基及培养条件，并通过诱导花芽形成过程中生理生化指标的动态监测，初步得出可溶性蛋白、可溶性总糖含量、SOD活性及IAA含量与花芽诱导率成正相关，而ABA含量维持相对稳定对花芽分化有促进作用。