陆少君 ，蔡肇栩 ，陈文健，刘瑶

（1.广东药科大学实验动物中心，广东广州 510006；2.肇庆市第一人民医院药学部，广东肇庆 526000；3.广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所，广东广州 510006）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在无过量饮酒史的情况下，肝组织学的改变类似于酒精性肝病，表现特征主要为肝细胞内脂肪过度沉积和脂肪变性[1]。近年来随着世界范围内糖尿病和肥胖发病率的上升，NAFLD发展迅速，现已成为世界性最常见的肝脏疾病之一。全球流行病学研究显示[2]，西方国家成年人中NAFLD 患病率约为20%～30%，而仅在美国，总人口的27%～34% 患有NAFLD，其中儿童占10%，75%～92%的病态肥胖患者也都患有NAFLD，这些NAFLD患者中有10%～15%发展为肝细胞癌。我国患病率低于西方国家，约为15%[3]，但随着肥胖人群增加与代谢综合征（metabolic syndrome,MS）的流行，患病率呈持续上升趋势，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病，给人们日常生活及社会带来极大负担。因此，寻找改善和治疗NAFLD 的药物具有十分重要的意义。

中药厚朴具有消除胸腹满闷、止痛、健胃、止咳、祛除水毒、活血化瘀等作用[4]。和厚朴酚（honokiol,HNK）是中药厚朴中提取纯化的主要有效化学成分，相对分子质量为266，分子式为C18H18O2，其化学结构如图1。属于一种带有烯丙基的连苯二酚类化合物[5]。现代医学研究发现，HNK 具有抗炎[6]、抗衰老[7]、改善胃肠功能紊乱[8]及抗肿瘤[9]等广泛的药理作用，但关于HNK 对灌服高糖高脂乳剂[10]复制的NAFLD 大鼠模型的作用研究尚未见报道。因此，本研究拟用高糖高脂乳剂制备NAFLD 大鼠模型，以中药单体HNK干预，探讨HNK对NAFLD大鼠模型的改善作用。

图1 和厚朴酚化学结构Figure 1 Chemical structure of honokiol

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，6周龄，广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCⅩK（粤）2018-0002。

1.2 药物及试剂

HNK（广州合诚化学有限公司）；辛伐他汀片（杭州默沙东制药有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，天津市大茂化学试剂厂）；葡萄糖（广州化学试剂厂）；三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、游离脂肪酸（FFA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；胰岛素（FINS）检测试剂盒[罗氏诊断产品（上海）有限公司]。

1.3 主要仪器

血糖仪及配套试纸[强生（中国）医疗器材有限公司]；FA2004B 电子天平（上海精科天美）；TC-120智能程控生物组织自动脱水机、TB-718D 生物组织自动包埋机、TB-718生物组织自动包埋机冷台、TK-218Ⅱ型恒温摊片烤片机、TR-180I型生物组织全自动染色机（湖北泰维科技公司）；RM2235 石蜡切片机（德国leica公司）；BA310正置显微镜及Motic Images Plus 3.0图像采集系统（麦克奥迪）。

2 方法

2.1 药物配制

辛伐他汀片及HNK 用0.5%CMC-Na 混悬后使用。

2.2 动物造模、分组及给药

6 周龄雄性SD 大鼠60 只，适应性饲养3 d，随机选取12 只大鼠作为正常对照组，灌服10 mL/kg生理盐水，其余大鼠灌服等量高糖高脂乳剂复制NAFLD 大鼠模型。2 周后所有动物以乙醚麻醉，静脉采血取血清测定TC 值，按TC 值把造模大鼠随机分成模型对照组、辛伐他汀阳性组（8 mg/kg）及HNK高、低剂量组（200、50 mg/kg）。分组后上午造模给药，下午治疗给药，正常对照组及模型对照组给予等量的0.5%CMC-Na溶液，给药体积为10 mL/kg，连续给药6周，期间所有大鼠给予普通饲料喂养。

2.3 指标观察及测定

2.3.1 一般情况 实验过程中，观察各组大鼠的行为、精神状态、毛发、排泄物等情况。

2.3.2 OGTT 试验 末次给药前各组动物禁食不禁水12 h，尾静脉取血测定空腹血糖（FBG），随即灌服2 g/kg 的葡萄糖，给药体积为10 mL/kg，测定30、60、120 min 时间点的血糖值。以时间点为横坐标，血糖值为纵坐标，绘制曲线，统计分析血糖曲线下面积（AUC）。

2.3.3 血清中生化指标检测 末次给药后各组动物禁食不禁水12 h，麻醉后静脉取血，3 500 r/min 离心15 min 分离血清，测定大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA 及FINS 含量，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

2.3.4 脏器系数 脱臼处死大鼠取肝脏、胰腺，称质量并计算脏器系数，脏器系数=脏器湿质量（g）/体质量（g）×100%

2.3.5 肝组织病理形态学检查 各组动物取相同部位肝组织，用10%（φ）甲醛溶液固定，常规脱水、包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，于显微镜下观察肝组织中肝细胞脂肪变性程度，小叶炎症及肝细胞气球样变，参照文献[11]评分标准进行NAFLD 活动度积分（non-alcoholic fatty liver disease activity score，NAS）评分。

2.4 统计学处理

以SPSS 22.0 软件进行数据处理，实验数据均用表示，各组均数间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况

实验期间正常对照组大鼠生长活动状态良好，毛色光亮，精力充沛，排泄物未见异常。模型对照组动物精神低迷，毛发蓬乱无光泽，喜团聚蜷卧，大便不成型且气味较臭。辛伐他汀组及HNK 给药组较模型对照组活动状态好，毛色有光泽，仅个别出现行动迟缓，皮毛欠光泽，拉稀便的现象。

3.2 HNK对NAFLD大鼠肝脏的影响

3.2.1 各组大鼠肝脏大体观 正常对照组大鼠肝脏形态正常，色泽鲜红，被膜光滑有弹性，边缘锐利。模型对照组肝脏呈弥漫性肿大、被膜紧绷、土黄色、质脆，边缘钝厚，切面油腻，是典型的脂肪肝病变，肝脏系数显著升高（P＜0.01）。与模型对照组相比，HNK 高、低剂量组及辛伐他汀组大鼠肝脏色泽及病变均有明显改善。见表1及图2。

表1 HNK对NAFLD大鼠活动度积分的影响Table1 Effect of HNK on the activity score of rats with nonalcoholic fatty liver(,n=12)

表1 HNK对NAFLD大鼠活动度积分的影响Table1 Effect of HNK on the activity score of rats with nonalcoholic fatty liver(,n=12)

与正常对照组比较：△△P＜0.01；与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

图2 和厚朴酚对NAFLD大鼠肝脏的影响（HE，400×）Figure 2 Effects of HNK on liver of rats with nonalcoholic fatty liver disease(HE,400×)

3.2.2 各组大鼠肝组织病理改变 镜下结果显示正常对照组肝小叶结构完整，轮廓清晰可见，肝窦正常，肝索以中央静脉为中心呈放射状整齐排列，肝细胞胞质均匀，呈多边形，无变性；模型对照组肝小叶结构不清，可见淋巴细胞和浆细胞的炎性浸润，细胞核偏移，肝窦数量减少，肝索排列紊乱，肝细胞内有明显大小不等的脂滴空泡；辛伐他汀组及HNK高、低剂量组炎症细胞浸润现象明显减轻，脂肪空泡明显减少，肝细胞脂肪变性明显改善，结果详见图2。表1 统计结果显示：模型对照组的脂肪变、小叶内炎症、气球样变评分及总评分NAS均显著高于正常对照组（P＜0.01）；NAFLD 模型鼠在给予辛伐他汀及HNK 治疗后，脂肪变、小叶内炎症及气球样变评分均有不同程度的下降（P＜0.01 或P＜0.05），NAS 评分显著小于模型对照组（P＜0.01）。结果表明HNK能改善NAFLD大鼠肝脏的肝细胞损伤。

3.3 HNK对NAFLD大鼠血脂水平的影响

表2结果显示：与正常对照组比较，模型对照组血清中TC、TG、LDL-C、FFA 水平显著性升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，HNK 高、低剂量组血清中TG、FFA 水平显著性下降（P＜0.01），HDL-C 显著升高（P＜0.01），高剂量HNK 能显著降低血清中TC水平（P＜0.05），低剂量HNK 则能有效控制NAFLD大鼠血清中的LDL-C 水平（P＜0.01）。表明HNK 对NAFLD大鼠的血脂紊乱有较好的调节效果。

表2 HNK对NAFLD大鼠血脂水平的影响Table 2 Effect of HNK on blood lipid level in NAFLD rats(,n=12)

表2 HNK对NAFLD大鼠血脂水平的影响Table 2 Effect of HNK on blood lipid level in NAFLD rats(,n=12)

与正常对照组比较：△△P＜0.01；与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 HNK 对NAFLD 大鼠血糖、血清FINS、HOMAIR的影响

表3 结果显示：模型对照组120 min 血糖水平、AUC 显著性高于正常对照组（P＜0.01）；与模型对照组比较，HNK 高、低剂量组120 min 时血糖及AUC显著性降低（P＜0.01 或P＜0.05）。表4 结果显示：与正常对照组比较，模型对照组的胰腺系数、FINS 水平及HOMA-IR 显著性升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，HNK 高、低剂量组的胰腺系数及HOMA-IR显著性下降（P＜0.01 或P＜0.05）。表明HNK 能改善NAFLD 模型鼠因胰腺炎及胰腺中脂肪的蓄积引起的胰腺肥大，增加口服糖耐量，减轻胰岛素抵抗。

表3 HNK对NAFLD大鼠血糖的影响Table 3 Effect of HNK on blood glucose in NAFLD rats(,n=12)

表3 HNK对NAFLD大鼠血糖的影响Table 3 Effect of HNK on blood glucose in NAFLD rats(,n=12)

与正常对照组比较：△△P＜0.01；与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

表4 HNK对NAFLD大鼠FINS水平和HOMA-IR 指数的影响Table 4 Effect of HNK on FINS level and HOMA-IR index in rats with nonalcoholic fatty liver disease(,n=12)

表4 HNK对NAFLD大鼠FINS水平和HOMA-IR 指数的影响Table 4 Effect of HNK on FINS level and HOMA-IR index in rats with nonalcoholic fatty liver disease(,n=12)

与正常对照组比较：△△P＜0.01；与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

4 讨论

NAFLD 属于一种具有高发病率的代谢紊乱性疾病，是最常见的肝脏疾病之一，其发病是一个多因素、多环节相互作用的过程。目前NAFLD的确切发病机制仍未被阐明，缺乏明确、系统的药物治疗策略，因此治疗NAFLD的药物研发依然任重而道远。

糖脂代谢紊乱包括胰岛素抵抗（IR）、糖耐量异常和脂质代谢改变，被认为是NAFLD 分子发病机制[12-13]。当机体饮食过度导致营养过剩时，脂质转录因子包括碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）以及甾醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）上调，导致脂肪生成基因的表达增加，乙酰辅酶a 羧化酶（ACC）升高，促进新生脂肪生成（NDL），抑制肝内脂肪酸氧化作用来驱动脂肪变性[14]。1998年Day和Jame[15]提出的“二次打击”学说机制也认为高脂饮食患者由于摄入过量脂肪，引起血浆中游离的脂肪酸增加，导致胰岛素抵抗，当机体产生胰岛素抵抗时，其血液中的TG、LDL-C、极低密度脂蛋白胆固醇都会发生明显升高[16]，进而产生脂质代谢紊乱。肝脏积聚了大量脂肪后，脂质会因为肝内自由基生成增多而过氧化，肝细胞也因此而凋亡、坏死，最终演变成脂肪性肝炎、肝细胞坏死、肝纤维化甚至肝硬化和肝癌。本研究结果表明，8 周高糖高脂乳剂诱导的NAFLD 大鼠血脂水平，肝脏、胰腺系数，AUC，血清FINS 含量及HOMA-IR 均显著升高并出现典型的脂肪肝病样变，与李易水等[17]所制备的高脂饮食的动物模型血脂水平、病理病变吻合。HNK 干预后，能降低血清TG、TC、LDL-C 及FFA，升高HDL-C，脂肪肝病样变明显改善，120 min 的血糖几乎能恢复到初始血糖，表明HNK能调节血脂紊乱，有效对抗高糖高脂乳剂引起的肝脏损伤，改善葡萄糖调节受损和胰岛素抵抗。

HNK 是一种安全、有效的强抗氧化剂[18]，并有很好的抗炎效果[8-19]。高脂饮食的大鼠肝脏中过氧化产物丙二醛（MDA）升高，超氧化物歧化酶（SOD）水平降低，氧化应激增加，抗氧化能力下降[20]，血清或肝脏中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等细胞因子亦会显著增加[21-23]。因此，笔者认为HNK 可能抑制了NAFLD 模型大鼠机体内乳酸脱氢酶（HDL）和转氨酶的释放，有效控制肝细胞死亡和脂质过氧化，产生较高活性氧并消耗细胞内的谷胱甘肽，同时减少了促炎症因子TNF-α及脂肪细胞因子FFA 的产生，从而起到肝脏细胞保护的作用。

综上所述，HNK 对NAFLD 大鼠模型有调节血脂紊乱、改善肝脏损伤及胰岛素抵抗的作用，但HNK对NAFLD大鼠模型的改善作用是一个多因素参与的复杂过程，其具体的作用机制有待更深入的探究。本研究为应用HNK 治疗NAFLD 提供了实验依据。