王颖，赵玉哲，韩青青，李思佳，张静

1河北医科大学研究生学院，石家庄 050000；2河北省人民医院腺体外科

甲状腺癌是内分泌系统中常见的恶性肿瘤，近年来发病人数持续增长[1]。2019年国家癌症中心的统计数据显示，甲状腺癌在全人群中发病率已位居第七位，甲状腺癌逐渐引起关注，但其发病机制还不明确[2]。甲状腺癌中乳头状癌最为常见，高分辨率超声结合细针穿刺活检一度被认为是术前诊断甲状腺癌的黄金搭档，但部分患者的甲状腺肿瘤相对较小，从而影响肿瘤性质的精准判断。

基因芯片又称DNA微阵列，是一种生物芯片，已成为大规模高效获取癌症基因表达谱信息的重要手段。微阵列分析是研究肿瘤基因、寻找肿瘤药物治疗的分子靶点、监测预后的一种新方法。然而，由于实验样本的异质性，使用不同的检测平台和数据处理方法会导致结果不一致。基于此，本研究以基因芯片研究为基础，应用整合的生物信息学技术进行生物信息数据挖掘，对PTC进行全面系统的生物信息分析，以期探索与PTC发生发展相关的关键基因。

1 资料与方法

1.1 临床资料 从GEO数据库(Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载GSE3678、GSE60542、GSE6004和GSE53157数据集。这4个数据集均属于GPL 570平台，共包含53个组织样本，其中包括24个正常甲状腺组织样本和29个甲状腺乳头状癌样本。

1.2 差异基因的筛选 使用R语言Limma R软件包筛选每个数据集的DEGs。以|logFC|≥1和P<0.05为差异有统计学意义，并将各数据集中的基因按logFC排序，使用RoburRankAggreg(RRA)R包(Https://cran.rstudio.com/bin/windows/contrib/3.5/RobustRankAggreg_1.1.zip)对4组基因文件进行集成，并将上调和下调的DEGs列表保存起来，供后续分析。

1.3 功能注释和通路富集分析 应用David 6.8数据库(Https://david.ncifcrf.gov/)对整合的DEGs进行GO注释和KEGG途径富集分析，以了解基因参与的生物过程和信号传导途径。所有GO富集分析和KEGG途径分析的数据以P<0.05为差异有统计学意义。

1.4 蛋白质相互作用网络构建 应用String在线数据库(http://string-db.org)对412个整合DEGs进行分析，下载分析结果，使用Cytoscape3.8.0软件构建可视化的PPI关系网络，并用CytoHubba插件筛选枢纽基因。

1.5 模块分析 在Cytoscape3.8.0软件构建的PPI网络中，使用默认参数为“Degree Cutoff = 2”“Node Score Cutoff = 0.2”“K-Core=2”和“Max.Depth=100”的MCODE插件对PPI网络中的模块进行分析。

2 结果

2.1 差异表达基因 数据集GSE3678、GSE60542、GSE6004及GSE53157分别筛选出700、887、772、1 088个DEGs，通过等级分析，鉴定了412个整合的DEGs，包括209个表达上调基因和203个表达下调基因。

2.2 DEGs的功能注释及富集 GO功能注释分为三部分：生物过程、分子功能和细胞成分。上调基因主要富集于基因表达的正调控、细胞外外泌体和钙离子结合，下调基因主要富集于信号转导、膜的组成部分和钙离子结合。

2.3 DEGs的KEGG通路 利用DAVID数据库对集成的DEGs进行了KEGG路径分析，整合后的DEGs主要富集于5种途径，即癌症的途径、PI3K-Akt信号转导通路、癌症中的蛋白多糖、黏着斑，ECM受体相互作用。

2.4 蛋白质—蛋白质相互作用(PPI)网络 为了确定这些DEGs在PTC中的相互作用，我们利用String在线数据库对412个整合DEGs进行了分析，并构建了一个PPI网络。在此基础上利用Cytoscape软件中的CytoHubba插件根据其程度值筛选出前10位核心基因：FN1、CDH2、APOE、TIMP1、CCND1、SERPINA1、MET、LPL、RUNX2、ITGA2，见表1。

表1 前10位枢纽基因的相关信息

2.5 功能模块 利用Cytoscape软件中的MCODE模块从PPI网络中筛选了14个功能模块，并选择了三个最重要的模块(如图1)。利用David数据库对这三个模块中的所有基因进行了KEGG途径富集分析(表2)。结果表明，模块1的基因主要富集于ECM受体相互作用，模块2的基因主要富集于矿物质吸收，模块3的基因主要富集于钙信号通路、癌症中的中心碳代谢、癌症的途径。

表2 前三个模块中基因的KEGG富集

注：圆圈代表基因；线条代表基因编码蛋白质之间的相互作用；线条颜色代表蛋白质相互作用的类型。

3 讨论

甲状腺癌是目前全球增长速度最快的癌症，其中PTC占比逐渐上升，已成为甲状腺癌诊治的焦点。当甲状腺结节经过细针穿刺活检(FNA)确诊或可疑癌肿时，推荐首选手术切除。但术前仍有部分患者无法通过超声及细针穿刺活检确定肿瘤性质，导致一部分不必要的手术。

本研究共筛选出412个整合DEGs，其中209个上调基因和203个下调基因。对差异基因进行GO功能及KEGG通路富集分析发现，上调基因在基因表达的正调控、细胞外外泌体和钙离子结合等方面存在显著富集，下调基因在信号转导、膜的组成部分和钙离子结合等方面存在显著富集。这些基因主要参与癌症的途径、PI3K-Akt信号转导通路、癌症中的蛋白多糖、黏着斑、ECM受体相互作用等与肿瘤发生相关的信号通路。模块中所涉及基因的KEGG通路分析再次验证了ECM受体相互作用及癌症的途径通路与PTC的发生发展密切相关。我们还构建了包含412个整合DEG的PPI网络，并鉴定出以下10个枢纽基因：FN1、CDH2、APOE、TIMP1、CCND1、SERPINA1、MET、LPL、RUNX2、ITGA2。FN1是一种细胞外基质高分子糖蛋白，参与协调复杂的细胞黏附和迁移[3]。最新研究发现，FN1促进PTC的迁移和侵袭并预测PTC的淋巴结转移[4]。

本研究结果显示，PTC标本中FN1基因均上调，提示高水平的纤维连接蛋白表达可能是肿瘤转移的促进因子。与杨春伟等[5]研究结论一致。CDH2是经典钙黏蛋白家族的成员，在多种癌症中过度表达。体外实验结果显示,PTC组织中CDH2含量高于非癌性甲状腺组织，并通过激活MAPK/ERK、PI3K/Akt和p16/Rb信号通路促进甲状腺肿瘤的发生[6]，与本研究结果一致。APOE和LPL在脂质代谢中起重要作用，并被认为参与了恶性肿瘤的代谢途径，为肿瘤细胞提供额外的能量来源[7]。TIMP-1是一种多功能的天然基质蛋白抑制剂，被认为是肿瘤转移的负调节因子。通过保护细胞外基质的完整性来防止肿瘤细胞的侵袭和转移[8]，CCND 1/CyclinD 1是细胞周期G1/S期的调节因子[9]。TESHIMA等[10]发现，PTC区域淋巴结转移率、甲状腺外扩张率和腺内转移率与CyclinD 1免疫染色阳性率相关。本研究结果中PTC细胞中CCND1基因上调，CyclinD 1过表达可能是判断甲状腺恶性肿瘤生长和转移潜能的重要指标。

SERPINA1是一种蛋白酶抑制剂，已被认为是多种癌症的生物标志物。有实验表明SERPINA1在甲状腺良恶性结节的鉴别中起重要作用[11]。研究发现,MET在HGF/c-MET通路中起重要作用，与甲状腺癌亚临床中心淋巴结转移密切相关，MET可能是PTC的危险基因[12]。Runx 2是胚胎发生过程中一种重要的转录因子，可通过激活一组参与基质降解和细胞侵袭的基因，来调控甲状腺肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[13]。ITGA2在多种肿瘤中的过度表达，被认为参与了细胞黏附和细胞表面介导的信号传递[14]。CHARNAYA等[15]研究发现，BRAF突变的PTC细胞改变了RAS-RAF-MEK通路，导致细胞膜整合素受体及其配体—细胞外基质蛋白骨桥蛋白表达的改变，从而增加肿瘤细胞的转移潜能。因此，ITGA2可作为肿瘤进展和侵袭性肿瘤表型的潜在生物标志物。

综上所述,本研究筛选所得的10个关键基因可能在PTC发生发展中发挥重要作用，抑制ECM受体相互作用、癌症的途径通路可能是治疗PTC的有效方法。