赵文，杨兴尧，林炎水

成都医学院第一附属医院骨科，成都610500

糖尿病和骨质疏松症作为两种常见的慢性疾病，其发病率随着社会老龄化的加剧逐年上升。糖尿病患者出现骨量降低、骨骼脆性增加、骨骼微结构受损等病理改变，称之为糖尿病性骨质疏松症(DO)[1]。DO可明显增高患者脆性骨折发生风险，引发长期严重疼痛和运动功能障碍，提高患者致残率和致死率[2]。唑来膦酸现为绝经后女性抗骨质疏松治疗的常规用药，有相关研究已证明其可防止糖尿病动物的骨丢失和增加动物骨密度[3]。二甲双胍类药物为2型糖尿病患者一线口服用药，诸多学者对其是否具有抗骨质疏松效果进行了试验及临床调查研究。JOSEPH等[4]对23 000余例患者进行随访发现，服用二甲双胍的糖尿病患者的骨折风险小于未服用二甲双胍的糖尿病患者。LU等[5]对台湾30 000余例糖尿病患者进行长达15年的随访，发现接受二甲双胍治疗的DO患者骨质疏松率低于未接受二甲双胍治疗者。有研究报道，二甲双胍可通过激活AMPK而在体外成骨，从而促进成骨分化、骨基质合成和成骨细胞增殖[6]。JEYABALAN等[7]对雌性C57BL/6小鼠进行卵巢切除(OVX)后，给予二甲双胍干预，发现小鼠体内骨量无明显变化；对股骨骨缺损的雌性Wistar大鼠给予二甲双胍，发现其对骨折愈合无明显影响。故而二甲双胍对骨质的影响目前尚无明确结论。对于DO患者，唑来膦酸注射液可在不影响患者的体质量、血糖前提下改善患者骨质条件[8-9]。2019年6月—2020年6月，我们探讨了唑来膦酸联合二甲双胍联合使用对骨质新陈代谢的影响，为DO患者选择药物治疗提供参考，降低骨折风险。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：选择SPF级12周雄性BKS-Leprem2Cd479/Gpt品系db/db小鼠23只，平均体质量42 g，基因型为(Lepr)ko/ko，以及同品系的基因型为(Lepr)wt/wt的小鼠6只，平均体质量22 g，动物均购于中国江苏集萃药康生物科技有限公司。动物实验根据1996年修订的美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南(NIH出版物第80-23号)进行。药物及仪器：唑来膦酸注射液(密固达)购自成都医学院第一附属医院药剂科(Novartis pharm Stein AG schaffhauserstrasse 4332 Stein 瑞士，批号：SRH49)。盐酸二甲双胍缓释片(倍顺)购自成都医学院第一附属医院药剂科(成都恒瑞制药有限公司，批号：190721)。(ONETOUTH UltraVue)血糖仪、血糖试纸购于强生(中国)医疗器材有限公司；Micro-ct(型号：ZKKS-MCT-Sharp)。Thermo 组织脱水机 AS(英国赛默飞世尔公司)，Thermo组织切片机(英国赛默飞世尔公司)，Dako CoverStainer全自动HE染色机(丹麦Dako公司)，苏木精及伊红染料(丹麦Dako公司)。

1.2 动物喂养及给药方式 将6只wt/wt小鼠(正常小鼠，未患糖尿病)纳入WT组。再根据用药方案的不同，将23只db/db小鼠按随机表法分为四组：5只纳入DB/DB组、6只纳入唑来膦酸组(ZA组)、6只纳入二甲双胍组(MET组)、6只纳入联合用药组(CMT组)。在喂养期间，所有实验小鼠获得足够的纯净水和食物，于成都医学院SPF级动物实验中心饲养小鼠。室温为20～25 ℃，明暗交替照射12 h/12 h。WT组和DB/DB组每天给予等量生理盐水腹腔注射。ZA组仅第1次腹腔注射唑来膦酸注射液100 μg/kg[10]，之后每日给予MET组等量生理盐水腹腔注射。MET组每日给予200 mg/kg二甲双胍溶液腹腔注射[11]。CMT组仅第1次腹腔注射唑来膦酸100 μg/kg，之后每日腹腔注射二甲双胍200 mg/kg。四组小鼠分别干预5周。

1.3 小鼠体质量、血糖测定 常规饲料喂养5组小鼠，每2周测量小鼠体质量和血糖，每次测量时小鼠禁食8 h，然后经小鼠尾静脉采血，小鼠血糖值由血糖仪测定并显示。若小鼠血糖值高于血糖仪检测最大值，则记录为33.3 mmol/L。

1.4 各组小鼠胫骨平台切片观察 采用HE染色法。取对侧胫骨行病理检查，通过4%多聚甲醛中固定48 h，再经过脱钙、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片及HE染色，切片厚度为5 μm。在普通光学显微镜下放大50倍后观察并拍照。

1.5 骨保护素(OPG)表达测定 采用免疫组化染色法。使用OPG一抗(美国Abcam公司)在已经完成切片的胫骨组织上染色，正置荧光显微镜下观察骨组织切片免疫组化染色结果。随机选择5个镜下视野拍照并保存。使用Image-Pro Plus 6.0软件对阳性结果进行半定量分析。OPG染色阳性结果为胞浆呈棕黑色或者褐色，胞核为蓝色。

1.6 骨陷窝数量测算 采用台盼蓝—伊红(TE)染色。使用台盼蓝染色试剂(中国索莱宝公司)和伊红染色试剂(中国索莱宝公司)对胫骨组织切片染色，正置荧光显微镜下观察骨组织形态，观察区域为胫骨平台近端骨质，400倍光镜下观察染色后的组织形态、骨细胞、骨陷窝及破骨细胞，对每张切片随机选择5个视野，镜下拍照并记录骨陷窝数量，半定量分析骨陷窝数量。

1.7 小鼠胫骨影像学检查 将小鼠胫骨附着组织剔除干净,放入Micro-CT(型号：ZKKS-MCT-Sharp)对胫骨进行 X 射线扫描。数据处理软件：ZZKS-MicroCT4.1。将实验样本沿长轴固定于固定器内，能量/强度为70 kVP，100 μA 7 W，4帧叠加曝光时间100 ms，扫描时间为12 min。扫描完成后，选取距生长板远端0.7 mm、层厚1.5 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(ROI)进行三维重建，以最低阈值为66提取图像信息。使用其软件(SCANCO Medical AG)进行重建定量分析。参数如下: 连接密度(Conn．D),结构模型指数(SMI) ,骨密度(BMD),骨体积分数(BV/TV) ,骨小梁数量(tTb.N),骨小梁厚度(Tb.Th) ,骨小梁分离度(Tb．Sp)。

2 结果

2.1 各组体质量、血糖水平比较 WT组小鼠体质量增长缓慢，血糖保持稳定。DB/DB组和ZA组虽然体质量变化趋势与WT组一致，呈现逐渐增长的趋势，但DB/DB组和ZA组血糖仍维持在较高水平。MET组和CMT组小鼠体质量略有下降，血糖明显下降。见表1。

表1 五组小鼠体质量及血糖水平比较

2.2 各组小鼠胫骨平台切片观察结果 WT组骨小梁较多，骨髓腔内血细胞较多；而DB/DB组骨髓腔内脂肪细胞较多，骨小梁较少，骨小梁稀疏细小，伴有骨折；ZA组骨小梁断裂，数量较少，结构紊乱，间隙扩大，包括大量脂肪细胞；MET组和CMT组骨小梁较多，骨髓腔内血细胞较多，脂肪细胞较少。

2.3 各组OPG表达比较 WT组、DB/DB组、ZA组、MET组、CMT组OPG阳性面积分别为80.02±10.53、22.35±4.57、28.22±28.22、40.14±7.08、45.09±8.70。WT组OPG表达最高，DB/DB组OPG表达最低，CMT组OPG表达优于DB/DB组、ZA组和MET组，且次于WT组。使用Image-Pro Plus6.0软件计算染色结果阳性面积，且对组间差距行半定量分析。结果显示，WT组与DB/DB组、ZA组、MET组和CMT组相比，P均<0.05；DB/DB组与MET组、CMT组相比，P<0.05；DB/DB组与ZA组相比，P>0.05；ZA组与MET组相比，P>0.05；ZA组与CMT组相比，P<0.05；MET组与CMT组相比，P>0.05。

2.4 各组TE染色后骨陷窝计数比较 各组小鼠骨组织经TE染色后可见骨小梁上骨陷窝存在，部分为空骨陷窝。骨质表面可见少量破骨细胞，形态不一，成多核状。WT组、DB/DB组、ZA组、MET组、CMT组骨陷窝计数分别为(14.17±6.71)、(33.60±11.44)、(24.17±10.36)、(30.33±9.33)、(23.50±9.73)个，WT组和DB/DB组相比，P<0.05；WT组与MET组相比，P<0.05。WT组骨陷窝数量最少，ZA组和CMT组骨陷窝数量较DB/DB组减少，但MET组减少并不明显。

2.5 各组BV/TV、Conn.D、SMI、BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp比较 见表2。对样本行2D成像后，能观察到WT组的小鼠拥有较多的骨小梁，但DB/DB小鼠胫骨近端伴有大量缺损、空洞，骨小梁明显减少，骨髓腔变空。ZA组、MET组、CMT组能观察到骨小梁数量明显增多。SEG图中我们对ROI骨小梁进行成像，能看到WT组骨小梁最多，且集中、有序；DB/DB组小鼠骨小梁最少，并且细小、分散。

表2 各组Micro-ct扫描结果比较

3 讨论

db/db小鼠具有和2型糖尿病患者极为相似的症状，且在其出生4周后就出现高血糖、高血脂等生理表现，目前广泛运用于2型糖尿病的动物研究[12]。相关研究发现，db/db小鼠继发出现骨量降低、骨钙素水平降低、骨皮质强度降低[13]，故此将db/db小鼠作为2型糖尿病并发骨质疏松的动物模型。因绝经后的女性发生骨质疏松症的几率大幅度提高[14]，所以我们选择雄性的db/db小鼠进行试验以此排除性激素的变化对骨质疏松症的影响，单纯观察药物对骨质的作用。

对于二甲双胍抗骨质疏松的作用，国内外众多学者进行了临床和多种基础实验研究，至今争论不一。在动物模型水平的研究中发现，二甲双胍可防止去卵巢(OVX)大鼠的骨丢失[15]，增加骨小梁的数量，抑制破骨细胞的生长[16]。在分子水平方面，二甲双胍能促进成骨过程相关基因的表达，如RUNX2和ALP；抑制成脂过程相关基因表达，如PPARγ和C/EBPα等[15]；抑制核因子κB配体(RANKL)诱导的Raw264.7巨噬细胞中的破骨细胞分化[17]。这些结果的差异可能是因为不同研究中用药剂量和持续时间的不同、统计学方法的差异。由于众多体外实验均提示二甲双胍对于抗骨质疏松治疗有积极作用，故我们推测唑来膦酸联合二甲双胍能起到更好的抗骨质疏松治疗效果。

二甲双胍的降糖作用现已得到医学界共同认可。本次实验中db/db小鼠胫骨的HE染色切片和TE染色切片中很少发现成骨细胞和破骨细胞，这可能是由于高糖高渗的环境不利于其生长[18-19]。另外，糖尿病患者因长期血糖升高，导致微小血管出现一系列的不良转变，即我们所熟识的糖尿病主要并发症之一。血管作为骨组织的营养物质输送者，其损伤很可能对骨量、骨结构有所影响[20]。本研究中加用二甲双胍后经HE染色发现，骨组织髓腔内脂肪细胞数量出现明显减少，镜下观察到血管增多，且伴有造血细胞增多，其中血管的增多我们认为可能与二甲双胍可在一定程度上通过减轻炎症反应[21]保护血管内皮细胞来修复血管[22]有关。我们还观察到骨髓腔内血细胞的增多，这可能是因为血管的增多后的连带作用，也可能是二甲双胍本身就拥有促进血细胞增殖的功能，这还需要进一步的探究。另一方面，即使加用二甲双胍后，HE染色下的成骨细胞和破骨细胞依旧很少。虽有体外实验报道二甲双胍能够促进骨向分化BMSCs的增殖和分化，抑制脂向分化BMSCs的分化，也能够促进成骨细胞的分化与矿化[17]，但就本实验结果来看，还不足以抑制高糖高渗环境对成骨细胞的负面影响。

我们对所有小鼠胫骨样本进行HE染色，发现只使用唑来膦酸的db/db小鼠骨髓腔内有大量脂肪细胞，骨小梁数量较未使用药物的db/db小鼠稍多。只使用二甲双胍的db/db小鼠骨髓腔内脂肪细胞明显减少，造血细胞增多，骨小梁数量较未使用药物的小鼠稍多。而联合使用两种药物的db/db小鼠，骨髓腔内所呈现的结果包含了两种药物单独的优点，骨髓腔内脂肪细胞减少，骨小梁数量增多。进行成骨细胞OPG免疫组化染色后，联合用药组的小鼠成骨细胞表达水平也是高于单独使用两种药物的db/db小鼠。在随后的TE染色中，我们采用半定量分析的方法，计算各组小鼠胫骨骨质骨陷窝数量，发现了出现明显骨质疏松的db/db小鼠拥有更多的骨陷窝，并且伴有部分空骨陷窝。单独使用唑来膦酸的db/db小鼠的骨陷窝数量与联合用药组相当，但是单独使用二甲双胍的db/db小鼠的骨陷窝数量并无显著减少。经Micro-ct扫描得到的数据发现使用唑来膦酸后的db/db小鼠的骨质优于未使用的小鼠。加用二甲双胍后，db/db小鼠在骨小梁数量、SMI出现优势，在一定程度上说明加用二甲双胍后，抗骨量丢失以及抗骨质疏松优于单用唑来膦酸。出现这种结果我们考虑可能是由于二甲双胍抑制了脂肪细胞的增殖、促进血管的修复，改善骨质血供进而改善骨质。但本次实验因样本量小，其他骨微结构指标差异不明显，存在一定统计学偏倚。

综上所述，唑来膦酸联合二甲双胍能在一定程度上能降低db/db小鼠的骨量丢失，并优于单独使用唑来膦酸或二甲双胍来抗骨质疏松治疗。