杨 阳，徐 鹏，张毓珍，崔留欣，黄 辉

1)郑州大学第一附属医院医院感染管理科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院感染性疾病科 郑州 450052 3)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 450001

大气颗粒物是影响大气环境质量和人体健康的主要危害因素之一，其中直径小于2.5 μm的细颗粒物(PM2.5)是雾霾的主要成分，现已成为公众和学界关注的重点[1-2]。有学者[3-5]研究发现，PM2.5可对呼吸系统、心血管系统、神经系统、生殖系统等造成损害。内质网应激是在多种生理或病理条件下，由于错误折叠蛋白或未折叠蛋白聚集导致的稳态失衡、生理紊乱[6]。近年有研究[7]报道，内质网应激可能是生殖细胞凋亡的重要途径之一。

α-硫辛酸(ALA)是一种独特的氧化应激强效抑制剂，近年来一直是抗氧化研究领域的热点，在糖尿病、急慢性肝炎、男性不育症、皮肤病等疾病的治疗中具有广大的应用前景[8-9]。氧化应激被认为是PM2.5引起机体损伤的重要机制之一[10]。本课题组前期研究[11]证实，氧化应激介导的内质网应激可能在氟中毒生殖损伤中发挥重要作用；而在PM2.5致睾丸支持细胞损伤中，ALA能否通过抑制氧化应激拮抗内质网应激，目前尚不明确。本研究以原代培养大鼠睾丸支持细胞为载体，建立PM2.5致睾丸支持细胞损伤模型，并采用ALA加以干预，探讨ALA对PM2.5引起的睾丸支持细胞内质网应激的影响，为PM2.5致雄性生殖系统损伤的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 PM2.5样品的采集及处理本研究所选取的采样地点为郑州市某高校园区内，采样点周围主要为居民生活区，无明显工业污染且附近无高层建筑遮挡，该采样点具有该区域代表性。使用大流量粉尘采样器(TE6070，美国)采集PM2.5样品。采集完毕后，从采样器上取下石英纤维滤膜，置于干燥器中干燥平衡48 h后，使用分析天平对滤膜进行称重，将称重后的滤膜剪碎，转移至含有超纯水的烧杯中，超声振荡后，用8层纱布过滤振荡液，将滤液用冷冻干燥机冻干后收集于EP管中，于-80 ℃保存备用。

1.2 大鼠原代睾丸支持细胞的分离和纯化SPF级16～20 d龄雄性SD大鼠20只，由河南省实验动物中心提供，动物许可证编号：SCXK(豫)2010-0002。采用颈椎脱臼法处死大鼠，放入体积分数75%乙醇中浸泡5 min后转移入超净台，然后按照本课题组前期实验方法[12]对睾丸支持细胞进行分离、培养以及纯化。提取的原代细胞加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中进行培养，并制备细胞悬液。

1.3 实验分组及处理方案根据预实验结果确定PM2.5染毒剂量为100 mg/L，ALA作用剂量为200 mg/L，作用时间为24 h。将离体培养2 d的原代睾丸支持细胞分4组：对照组(0 mg/L PM2.5)、ALA组(200 mg/L ALA)、PM2.5组(100 mg/L PM2.5)和ALA+PM2.5组(200 mg/L ALA+100 mg/L PM2.5)。

1.4 细胞活性的MTT法测定取制备好的细胞悬液，按照5 000个/孔(每孔200 μL)接种于96孔板，48 h后分组加药后继续孵育24 h，每组设6个复孔。培养结束前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液，培养结束时，小心吸弃孔内上清液，每孔再加入150 μL DMSO，振荡5 min，以便蓝紫色结晶物充分溶解。用酶标仪在492 nm波长下测定各孔吸光度。细胞存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。

1.5 细胞中氧化应激水平检测①细胞内活性氧(ROS)检测(检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司)：取制备好的细胞悬液，调整细胞密度为2×105个/mL，每孔2 mL接种于6孔板，培养2 d后，更换培养基，按照1.3中分组加药后继续培养24 h，消化收集。用无血清培养基稀释10 mmol/L的DCFH-DA荧光探针，将细胞悬浮于稀释的含探针的培养基中，置于37 ℃培养箱20 min，采用流式细胞仪检测DCF荧光，每个样本检测2×104个细胞。②细胞内丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力检测(检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所)：调整细胞密度为2×104个/mL，每孔2 mL接种于6孔板，按照1.3方法分组培养。用超声破碎法制备细胞匀浆，用于MDA含量及SOD活性的测定，上述操作均按照试剂盒说明书进行，各组检测设6个复孔。

1.6 细胞中GRP78、IRE1和CHOP蛋白表达的Western blot法测定收集制备的睾丸支持细胞悬液，用预冷PBS冲洗两遍，加入细胞裂解液(每100 μL中加入1 μL蛋白酶抑制剂)冰上裂解约15 min，低温12 000 r/min离心8 min后吸取上清，BCA法测定蛋白浓度。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上。分别加入GRP78、IRE1和CHOP的兔多克隆抗体(均购自武汉三鹰生物技术有限公司，均按1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜，次日加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h，ECL化学发光法显色，Bio-Rad凝胶成像系统收集图像，Quanlity one软件对结果进行光密度分析。以GAPDH为内参，目的蛋白条带与GAPDH条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学处理采用SPSS 12.0分析数据，应用2×2析因设计的方差分析比较各组细胞存活率、细胞内ROS、MDA含量、SOD活力及GRP78、IRE1和CHOP蛋白表达水平的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞存活率和细胞内ROS、MDA及SOD水平的比较见表1。由表1可知，PM2.5作用24 h可降低睾丸支持细胞存活率，增高细胞内ROS水平和MDA含量，降低SOD活力；而ALA可拮抗PM2.5的上述作用。

表1 4组细胞存活率，ROS、MDA含量和SOD活力的比较(n=6)

2.2 4组细胞中GRP78、IRE1、CHOP蛋白表达的比较见图1、表2。由表2可知，PM2.5处理睾丸支持细胞24 h后，GRP78、IRE1、CHOP蛋白表达水平上调，而ALA可抑制PM2.5介导的蛋白表达上调。

图1 各组睾丸支持细胞中GRP78、IRE1、CHOP蛋白的表达

表2 4组细胞中GRP78、IRE1、CHOP蛋白表达水平的比较(n=6)

3 讨论

我国大气污染问题日益受到国内外学者的关注，由于PM2.5粒径小且比表面积大，极易吸附重金属等有毒物质，而生殖系统则是重金属产生毒作用的重要靶器官之一[13]。近年来有文献[14]报道，PM2.5可直接导致男性精子质量显著下降，PM2.5暴露水平与精子总数呈显著负相关。另外，关于PM2.5致机体损伤机制研究有很多，其中包括氧化应激、炎症因子、生殖激素和MAPK信号通路等[15-16]。有学者[17]研究发现，汽车尾气来源的PM2.5通过激活PI3K/AKT信号通路，导致生殖细胞中活性氧自由基生成增加，破坏血生精小管屏障，进而损伤雄性生殖功能。睾丸支持细胞具有为生精细胞提供营养、激素转化、屏障隔离和吞噬等作用，外源性化合物对其影响较大，且是许多毒物的靶细胞，在雄性生殖毒理学的研究中，较多采用体外培养睾丸支持细胞的方法。因此，本研究以原代培养的大鼠睾丸支持细胞为载体，建立PM2.5染毒细胞模型，本实验结果显示，PM2.5染毒可引起睾丸支持细胞存活率降低，ROS水平、MDA含量升高及SOD活力降低，内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1、CHOP表达上调。上述证据进一步验证了PM2.5可引起睾丸支持细胞发生氧化应激和内质网应激。

ALA广泛存在于自然界动植物及微生物中，具有独特双硫键抗氧化分子结构，可清除氢氧自由基、氢氧化物等氧化应激产物；还可与二氢硫辛酸相互转化，还原内源性抗氧化酶，使其恢复活性；其是细胞线粒体的主要酶之一，能以辅酶形式参与能量形成，发挥其生理作用[18]。近年来ALA在临床上的应用取得了明显成效，且ALA对精子损伤的保护作用受到国内外相关学者[19-20]的关注。据此考虑ALA能否在PM2.5致睾丸支持细胞损伤中发挥作用。本实验结果表明，ALA可提高睾丸支持细胞存活率，有效拮抗PM2.5组睾丸支持细胞氧化应激水平的升高。另有报道[21]显示，内质网是ROS的主要作用靶点之一，ROS可作用于内质网，导致内质网应激持续进行性激活。本研究发现，ALA有效拮抗了内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1和CHOP表达水平的上调，提示ALA可通过有效抑制睾丸支持细胞氧化应激降低PM2.5介导的睾丸支持细胞内质网应激。

综上所述，本研究证实了ALA能够通过减轻PM2.5引起的氧化损伤保护睾丸支持细胞，提高细胞存活率，且能够拮抗PM2.5对内质网应激相关蛋白表达的上调。以上结果提示，ALA可通过抑制氧化-内质网应激信号通路，对PM2.5介导的大鼠睾丸支持细胞损伤起到一定的保护作用。而目前ALA对PM2.5致雄性生殖损伤作用的研究仅涉及体外实验，仍需进一步体内研究明确其疗效，以期为PM2.5致雄性生殖损伤的防治提供新的思路。