沙爱龙 ，赵雪雯，何璐汐，黄燕婕

(1.重庆三峡学院教师教育学院，重庆 万州 404120；2.重庆三峡学院生物与食品工程学院/重庆市渝东北特色生物资源开发利用工程技术研究中心，重庆 万州 404120)

【研究意义】茶是生活中的常见饮品，饮茶与喝咖啡一样，已成为人们日常的生活习惯。研究茶与咖啡的药用价值，可使其更好、更正确的为人类所用。【前人研究进展】已有研究报道，二者均能兴奋中枢神经、影响心脏，是因为二者的成分中有相似物质所致。茶叶中含有茶多酚、咖啡碱、茶碱、可可碱、茶氨酸、黄酮类化合物等主要成分[1]，其中所含茶多酚、咖啡碱、茶氨酸、黄酮等物质与兴奋神经、影响心脏相关[2-4]。如有研究表明，提取自藤茶的黄酮类化合物对心肌损伤具有显著保护作用[4]；茶多酚、茶氨酸对周围神经具有保护和修复作用[5-6]，其中汤银娟等研究证实茶多酚能促进小鼠坐骨神经的感觉功能和该神经所支配的腓肠肌运动功能[5]。而普洱茶(Camelliasinensisvar.Assamica)和粗壮女贞苦丁茶[Ligustrumrobustum(Roxb.) Blume]中均含有茶多酚、茶氨酸、黄酮等成分[7-8]。【本研究切入点】目前尚未见两种茶对心脏、周围神经和骨骼肌收缩性的影响研究报道。【拟解决的关键问题】探究两种茶提取物对牛蛙(RanacatesbianaShaw)离体心脏、在体坐骨神经-腓肠肌的影响及其作用机制，以期为两种茶提取物在临床上的开发利用提供理论基础和依据。牛蛙的心脏由心肌构成，而其腓肠肌由骨骼肌构成，心肌和骨骼肌在细胞结构、收缩性、兴奋性、传导性等生理特性和收缩机制方面均不尽相同，因此当两种茶提取物作用于牛蛙心脏和腓肠肌时，对二者生理特性影响程度和变化很可能不同。

1 材料与方法

1.1 实验动物

牛蛙54只，购于重庆市万州区五桥永辉超市，体重340～380 g。

1.2 仪器

BL-420F生物信号采集处理系统、张力换能器和引导电极，成都泰盟软件有限公司；iMark酶标仪，美国Bio-RAD；UV-1200型紫外可见分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司；FA2004电子天平，上海津平科学仪器有限公司；台式离心机，湖南平凡科技有限公司。

1.3 试剂

普洱茶(熟茶)，安宁海湾茶业有限责任公司；粗壮女贞苦丁茶，宜宾川红茶叶集团有限公司；乙酰胆碱(Ach)ELISA试剂盒，美国cloud-clone公司；乙酰胆碱酯酶(A-CHE)测试盒，南京建成生物工程研究所；硝酸毛果芸香碱和自制任氏液(6.5 g NaCl、0.14 g KCl、0.12 g CaCl2、0.2 g NaHCO3、0.01 g NaH2PO4、2 g 葡萄糖、1000 mL蒸馏水)，国药集团化学试剂有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 普洱茶提取物和粗壮女贞苦丁茶提取物的制备 分别参照王友兰等[9]和胡顺莉等[10]方法制备两种茶提取物：称取普洱茶或苦丁茶2 g，放在纱布中，分别置于100 ℃沸蒸馏水中浸泡3次，每次30 min，合并3次滤液浓缩至100 mL，得高浓度(2.00 g/100 mL)普洱茶提取物或苦丁茶提取物。然后将高浓度溶液加倍稀释，可得中浓度(1.00 g/100 mL)和低浓度(0.50 g/100 mL)普洱茶提取物或苦丁茶提取物。

1.4.2 制备牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌标本，给药及记录 参照课题组先前的研究方法制备在体坐骨神经-腓肠肌标本[11]：破坏牛蛙脑和脊髓后，在股二头肌和半膜肌之间的肌间沟内用玻璃分针游离出坐骨神经，将之轻挑至保护电极上；而后游离出腓肠肌，将腓肠肌通过张力换能器与BL-420F生物信号采集处理系统相连，记录。将坐骨神经、腓肠肌完全浸入到盛有普洱茶提取物或粗壮女贞苦丁茶提取物的培养皿中，浸泡10 min后立即记录腓肠肌收缩各指标。分别记录给药前和给药后的标本阈刺激、最大刺激和腓肠肌收缩潜伏期、收缩幅度、收缩时间、舒张时间。

1.4.3 两种茶提取物对坐骨神经-腓肠肌接头处Ach含量和A-CHE活性的影响 使用锋利刀片在坐骨神经-腓肠肌接头处取材，其中一部分标本立即置于塑料管内，密封后用液氮冷冻，以使乙酰胆碱酯酶失活，而后迅速用ELISA法检测Ach含量，操作步骤按照美国cloud-clone公司所提供试剂盒说明书进行；另称取0.1 g组织标本，加入1 mL提取液冰浴匀浆，在4 ℃下8000 r/min离心10 min后取上清液，按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书测定A-CHE活性。

1.4.4 离体蛙心的制备及给药 双毁髓处死牛蛙，暴露蛙心，蛙心室插管固定后离体蛙心，连张力换能器和BL-420F生物信号采集处理系统。蛙心收缩曲线稳定20 min后，分别灌注低、中、高浓度的普洱茶提取物或苦丁茶提取物，在每次灌流后均用任氏液进行3～5次冲洗，待牛蛙的心搏曲线稳定后，再进行下一组实验，并记录、观察蛙心收缩幅度变化。

1.4.5 两种茶提取物对CaCl2诱导的牛蛙离体心脏收缩幅度的影响 待心脏收缩曲线稳定后，向套管内任氏液中滴加CaCl2(0.1 mol/L)2滴，作用6 min后加入高浓度普洱茶提取物或苦丁茶提取物，观察记录蛙心收缩幅度变化。另设一组用盐酸维拉帕米(0.1 μmol/L)作为阳性对照。

1.4.6 两种茶提取物对Ach诱导的牛蛙离体心脏收缩幅度的影响 向收缩曲线稳定后的心脏灌流液中滴加Ach(0.1 μmol/L)2滴，作用6 min后加入高浓度普洱茶提取物或苦丁茶提取物，观察记录蛙心收缩幅度变化。另设一组用硝酸毛果芸香碱(0.1 μmol/L)作为阳性对照。

1.4.7 数据统计及分析 每组单收缩曲线中随机选取3个，完成潜伏期(ms)、收缩时间(ms)、收缩幅度(g)、舒张时间(ms)的测定； 其中，收缩速率=收缩幅度/收缩时间，舒张速率=收缩幅度/舒张时间，单位皆为g/ms。抑制率=(给药前平均值-给药后平均值)/给药前平均值，促进率=(给药后平均值-给药前平均值)/给药前平均值。用SPSS 22.0软件分析实验数据，结果用平均数±标准差(x±s)表示。普洱茶或苦丁茶处理前后数据用配对t检验或单因素方差分析，进一步组间比较选用Dunnett-t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 两种茶提取物对牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌阈刺激、最大刺激和收缩潜伏期的影响比较

与浸润前相比，两种茶提取物浸润后牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌阈刺激、最大刺激和收缩潜伏期虽有一定程度减小，但差异均不显著(P>0.05,表1)。表明普洱茶提取物和粗壮女贞苦丁茶提取物对牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌的阈刺激、最大刺激和收缩潜伏期均无明显影响。

2.2 两种茶提取物对牛蛙在体腓肠肌收缩幅度、收缩速率、舒张速率和坐骨神经-腓肠肌接头处Ach含量、A-CHE活性的影响比较

坐骨神经-腓肠肌接头处兴奋的传递过程需要电信号触发接头前膜的Ca2+通道，突触囊泡量子释放出Ach，Ach与终板膜中N2型Ach受体阳离子通道结合引起终板电位，从而完成兴奋传递，随后Ach会被终板膜中乙酰胆碱酯酶水解[12]。由表2可知，与浸润前相比，两种茶提取物浸润后牛蛙在体腓肠肌收缩幅度、收缩速率和坐骨神经-腓肠肌接头处Ach含量均极显著增加(P<0.01)，腓肠肌舒张速率也明显变快，其中普洱茶提取物差异极显著(P<0.01)，粗壮女贞苦丁茶提取物差异显著(P<0.05)。而两种茶提取物浸润后坐骨神经-腓肠肌接头处A-CHE活性均极显著降低(P<0.01)。表明两种茶提取物均对牛蛙在体腓肠肌的收缩幅度、收缩速率、舒张速率和坐骨神经-腓肠肌接头处Ach含量、A-CHE活性有明显影响，其中普洱茶提取物较粗壮女贞苦丁茶提取物影响更明显。

已有研究表明，普洱茶主要成分有茶色素、茶多酚、茶多糖、茶氨酸、生物碱、黄酮类等[7]。其中茶色素含量高达15.19%～18.28%，茶多酚含量也可达9.03%～11.33%[7]。粗壮女贞苦丁茶主要成分有茶多酚、茶多糖、茶色素、生物碱、单萜类、黄酮类等[8]。其中茶多糖含量高达10.57%，茶多酚含量也可达8.80%[8]。本实验结果提示：普洱茶及粗壮女贞苦丁茶中的茶多酚可能作为非选择性磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，通过抑制对环磷酸腺苷(cAMP)有水解作用的PDE3和PDE4，以及对环磷酸鸟苷(cGMP)有水解作用的PDE5，进而使细胞内cAMP和cGMP水平升高，接着cAMP激活蛋白激酶A (PKA)、cGMP激活蛋白激酶G (PKG)[13]，促进终池内Ca2+进入肌浆，使肌浆内Ca2+浓度升高，最终与肌钙蛋白结合导致腓肠肌收缩增强。此外，两种茶提取物均能通过抑制牛蛙坐骨神经-腓肠肌接头处乙酰胆碱酯酶活性，从而使接头处Ach含量增加，最终促进腓肠肌收缩。

表1 两种茶提取物对牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌阈刺激、最大刺激和收缩潜伏期的影响比较

表2 两种茶提取物对牛蛙在体腓肠肌收缩幅度、收缩速率、舒张速率和坐骨神经-腓肠肌接头处Ach含量、A-CHE活性的影响比较

2.3 两种茶提取物对牛蛙离体心脏收缩幅度的影响

由表3可知，与给药前相比，不同浓度的普洱茶提取物和苦丁茶提取物对牛蛙离体心脏收缩幅度都具有一定的抑制作用，其中苦丁茶低浓度组影响不显著(P>0.05)，苦丁茶中浓度组和普洱茶低浓度组影响显著(P<0.05)，而苦丁茶高浓度组和普洱茶中、高浓度组影响均极显著(P<0.01)，且随茶提取物浓度的升高抑制率逐渐增强，呈一定的量效关系。相比较而言，同浓度的普洱茶提取物较苦丁茶提取物对牛蛙离体心脏收缩抑制更明显。

有研究表明，藤茶可通过舒张心肌、减缓心肌细胞凋亡、抑制动脉粥样硬化而保护心血管[4,14]。与本实验中普洱茶、苦丁茶的功效有相同之处。张毓等[15]和傅雷等[16]研究均表明，茶色素可使正常离体蛙心和心肌缺血蛙心的心肌收缩力增强，他们的研究结果均与本实验研究结果相反。普洱茶和苦丁茶的活性成分中均有茶色素[7-8]，但本研究表明普洱茶和苦丁茶对离体蛙心收缩具有抑制作用，充分说明普洱茶和苦丁茶中还具备抑制心脏收缩活性成分，该成分对蛙心收缩的抑制作用大于茶色素对蛙心收缩的促进作用，且普洱茶中该成分含量要高于苦丁茶。但具体是哪种活性成分对心脏收缩具有如此强的抑制作用，尚待进一步研究。

2.4 两种茶提取物对CaCl2诱导的牛蛙离体心脏收缩幅度的影响

心肌产生兴奋后通过兴奋-收缩耦联使胞内Ca2+浓度升高，再引发肌丝滑行而收缩心肌[17]。心肌细胞内所含Ca2+较少，主要来源于胞外，并对细胞外Ca2+的变化及药物作用十分敏感[18]。由表4可知，与给药前相比，单独应用CaCl2极显著增加了牛蛙离体心脏收缩幅度(P<0.01)。加入普洱茶提取物(2.00 g/100 mL)后，收缩幅度极显著降低(P<0.01)，作用效果与盐酸维拉帕米阳性对照相当。当加入苦丁茶提取物(2.00 g/100 mL)后，收缩幅度显著降低(P<0.05)，作用效果与盐酸维拉帕米相比要差一些，盐酸维拉帕米与CaCl2相比差异极显著(P<0.01)。盐酸维拉帕米为常用的L型钙通道(ICa-L)阻断药，因此说明普洱茶和苦丁茶可能对ICa-L具有阻断作用，使胞外Ca2+内流减少。

2.5 两种茶提取物对Ach诱导的牛蛙离体心脏收缩幅度的影响

由表5可知，与给药前相比，单独应用Ach极显著降低了牛蛙离体心脏收缩幅度(P<0.01)。加入普洱茶提取物(2.00 g/100 mL)后，收缩幅度进一步下降，与Ach相比差异极显著(P<0.01)，作用效果与硝酸毛果芸香碱相当。当加入苦丁茶提取物(2.00 g/100 mL)后，收缩幅度也进一步下降，与Ach相比差异显著(P<0.05)，作用效果与硝酸毛果芸香碱相比要差一些，硝酸毛果芸香碱与Ach相比差异极显著(P<0.01)。硝酸毛果芸香碱为常用的M胆碱受体激动药，说明普洱茶和苦丁茶可激活心肌细胞膜上的M受体，使细胞内cAMP浓度减少，抑制胞外Ca2+内流。

表3 两种茶提取物对牛蛙离体心脏收缩幅度的影响

表4 两种茶提取物对CaCl2诱导的牛蛙离体心脏收缩幅度的影响

表5 两种茶提取物对Ach诱导的牛蛙离体心脏收缩幅度的影响

3 讨 论

心肌收缩与骨骼肌收缩存在差异。由于骨骼肌细胞和心肌细胞产生兴奋的时间不同，骨骼肌细胞动作电位产生快，故骨骼肌可以产生强直收缩；而心肌细胞动作电位持续时间长，心肌细胞兴奋过程中有效不应期特别长，故心肌不会产生强直收缩，其收缩和舒张始终会交替进行[18]。此外，心肌和骨骼肌在细胞结构、传导性、收缩机制方面也存在差异。诸多差异便导致两种茶提取物对心肌和骨骼肌生理特性影响程度和变化不同。

本实验材料之所以选用牛蛙是因为：牛蛙骨骼肌细胞和心肌细胞的生物电活动、骨骼肌和心肌的收缩舒张等都与人、哺乳动物相似[18]，肌丝滑行等生理学有关理论也可以用来解释牛蛙的生理特性，可通过研究药物对牛蛙心肌、骨骼肌的影响，从而研发适用于人、哺乳动物的药物；牛蛙为变温动物，离体后的心脏、腓肠肌不需要保证恒温环境，其心脏无冠状动脉，心肌细胞直接从心腔血液中获得营养物质和氧气，不需要额外供氧，因此在一定时间内其心脏可以节律性的兴奋、收缩[17]。总之，牛蛙离体心脏和在体坐骨神经-腓肠肌所需生存条件比较简单，易于掌握和控制，可以在室温条件下一段时间内保持生理活性，故选用牛蛙作为实验材料，可研究两种茶提取物对人、哺乳动物心脏和骨骼肌生理特性的影响。

4 结 论

综上所述，普洱茶提取物和苦丁茶提取物均对骨骼肌收缩舒张具有促进作用，作用机制与通过促进终池内Ca2+进入肌浆，使肌浆内Ca2+浓度升高和通过抑制接头处A-CHE活性，使Ach含量增加有关；两种茶提取物均能抑制离体蛙心收缩，均能协同Ach对离体蛙心收缩幅度的抑制作用、抑制CaCl2对其促进作用，作用机制可能与阻断ICa-L和激活心肌膜M受体，使胞内cAMP浓度减少抑制胞外Ca2+内流有关。无论对骨骼肌还是心肌，都是普洱茶提取物较粗壮女贞苦丁茶提取物影响更明显。由此可推断，普洱茶和粗壮女贞苦丁茶均具备良好的药用价值，可望用于心肌损伤、心肌炎、高血压等疾病的辅助治疗。两种茶均能增强体力，增强机体的抗疲劳能力[19]，尤以普洱茶效果更佳。常感觉疲劳的亚健康人群、骨骼肌疾病(如肌营养不良症、代谢性肌病)患者常饮用普洱茶和粗壮女贞苦丁茶能辅助疾病的康复，可谓此类患者的“良好伴侣”。