李昌哲，洪秋月，李军，杨光红，赵华，胡婷**

(1.贵州医科大学 环境污染与疾病监控教育部重点实验室 毒性检测中心，贵州 贵阳 550025;2．贵州医科大学 公共卫生学院，贵州 贵阳 550025;3．贵州医科大学 公共卫生学院 环境卫生与职业卫生教研室，贵州 贵阳 550025)

瑞香狼毒俗称狼毒、断肠草等，是瑞香科狼毒属植物，其成分主要包含香豆素、黄酮、二萜原酸酯以及木脂素类等化合物[1]。《神农本草经》记载，瑞香狼毒有“主咳逆上气，破积聚，恶疮，鼠瘘疽蚀”等功效[2]；现代药理研究发现，瑞香狼毒素在抗肿瘤、抗HIV以及抗菌等方面有生理活性[3-5]。近年来，瑞香狼毒素被广泛用于农业害虫防治、抗真菌抗螨虫的药剂开发中[6-7]，与人的接触机会增加，虽然瑞香狼毒素的药用价值明显，但其潜在风险也不应被忽视。有报道提出瑞香狼毒素属低毒物质，具有一定胃毒毒性[8-9]，可引发腹泻、皮疹等不良反应[10]。瑞香狼毒素引起的胃肠道毒性作用究竟有多严重，转归如何鲜见报道，本研究针对这一问题展开研究，以期为瑞香狼毒素制剂的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康断乳的SPF级SD大鼠，体质量100～120 g，共50只，雌雄各半，购于贵州医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK(黔)2017-0027。

1.1.2实验试剂和仪器 瑞香狼毒素(有效成分含量为20%)，由贵州医科大学毒性检测中心提供；胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)Ⅰ(PGⅠ)和Ⅱ(PGⅡ)生化套装，购自浙江宁波瑞源生物科技有限公司；一抗缝隙连接蛋白43(connexin43，CX43)，购自abcam(批号GR3271571-13)；内参β-actin，购自bioss(批号AH01032107)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，购自碧云天生物技术研究所；其余试剂均为国产分析纯。组织脱水机、包埋机、切片机、全自动染色机、光学显微镜均为德国徕卡；全自动生化分析仪(AU400，日本奥林巴斯)、超级酶标仪(MQX200，美国Bio-Tek公司)、高速冷冻离心机(5417R，德国Eppendorf公司)、凝胶成像仪(Chemi DocTMXRS+，美国Bio-Rad公司)、基础电泳仪(PowerPacTM，美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组和处理 50只SD大鼠经检疫和适应性喂养后，采用随机数字表法将其分为5组，每组10只，雌雄各半。对照组给予去离子水灌胃90 d。低、中、高剂量组：瑞香狼毒素溶于去离子水，染毒剂量分别为31.25、125.00、500.00 mg/kg，灌胃90 d。恢复组：瑞香狼毒素按500 mg/kg染毒剂量灌胃90 d后，不做任何处理再饲养7 d；以上各组每周灌胃6 d(每日1次)休息1 d，灌胃剂量为10 mL/kg。

1.2.2标本采集及保存 实验终期，采用7%水合氯醛麻醉大鼠，心脏采集非抗凝血2 mL，分离血清用于生化指标测定；将动物解剖后取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水清洗干净，观察胃黏膜的大体损伤情况，取损伤最严重的部位进行固定，用于之后的组织病理学检察，同时在此部位取胃壁组织0.02 g加预冷裂解液200 μL匀浆,12 000 r/min低温离心5 min,取上清液用于蛋白表达量测定。

1.2.3指标测定 (1)大鼠一般情况观察及体质量测量：实验期间，每天观察并记录动物的一般表现、行为和死亡情况，每周称重两次，计算各时间段的体质量增长率，体质量增长率(%)=[(后一时间点的体质量-前一时间点的体质量)/前一时间点的体质量]×100%;(2)血清指标检测：采用胶乳增强免疫比浊法检测血清PGⅠ和PGⅡ含量;(3)胃组织病理学检察：胃组织固定 48 h后，按常规方法制片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、光镜下检查组织形态结构;(4)胃组织匀浆CX43的测定：使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定胃组织匀浆蛋白浓度，根据蛋白浓度决定上样量；依次进行电泳、转膜、封闭，兔抗大鼠单克隆抗体(1/2 000)4 ℃孵育过夜后，辣根酶标记的山羊抗兔二抗(1/3 000)室温下孵育2 h，充分洗涤后ECL化学发光显影，使用凝胶成像仪拍摄图像并分析各条带的灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

实验期间高剂量组大鼠的活动程度明显减弱、精神状态呈低度萎靡，皮肤毛发较光泽、顺整，饮食减少、饮水量增多，大便基本成型，尿量增多、色黄，其余各组一般情况表现与对照组比较，无明显差异。

2.2 各组大鼠体质量和体质量增长率

与对照组相比，5～8周低、中、高剂量组大鼠的体质量增长率下降，9～13周高剂量组大鼠体质量增长率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

图1 瑞香狼毒素连续给药90 d各组大鼠的体质量变化Fig.1 Weight changes of rats treated with S. chamaejasme for 90 days

表1 各组大鼠体质量增长率比较Tab.1 Comparison of weight growth rate

2.3 血清PGI和 PGII

与对照组相比，中、高剂量组大鼠血清PGI降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与低剂量组相比，高剂量组PGI分泌量降低(P<0.05)；与对照组相比，高剂量组血清PGII含量降低(P<0.05)，低、中、高剂量组大鼠PGI /PGII比值降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与高剂量组相比，恢复组血清PGI、PGII含量和PGI /PGII比值变化不明显(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清中PGI、PGII和PGI/PGII比值Tab.2 The serum PGI,PGII,and PGI /PGII proportion of rats in each

2.4 胃组织学观察

对照组大鼠皮胃黏膜覆盖复层鳞状上皮，黏膜下富含血管；腺胃为单层柱状上皮，固有层含大量腺体，腺体间为少量结缔组织。高剂量组大鼠的胃黏膜上皮缺损，上皮反应性不典型增生与上皮细胞黏蛋白和纤维蛋白的渗出混合，胃腺萎缩和纤维化，基底部炎细胞浸润，部分被纤维包裹。恢复组的病变情况和高剂量组基本一致。见图2。

图2 各组大鼠胃组织学观察(HE,×100)Fig.2 Histology observation of gastric tissue of each group (HE,×100)

2.5 胃组织细胞CX43表达

与对照组相比，低、中、高剂量组胃组织匀浆CX43蛋白表达量下降(P<0.05)；与低剂量组相比，中、高剂量组胃组织匀浆CX43蛋白表达量下降(P<0.05)；与中剂量组相比，高剂量组胃组织匀浆CX43蛋白表达量明显下降(P<0.05)；与高剂量组相比，恢复组胃组织匀浆CX43蛋白表达量变化并不明显(P>0.05)。见图3。

注：(1)与对照组相比，P<0.05；(2)与低剂量组相比，P<0.05；(3)与中剂量组相比，P<0.05。图3 各组大鼠胃组织胃组织匀浆CX43蛋白表达Fig.3 CX43 protein expression on the stomach of rats in each group

3 讨论

随着医药事业快速发展，对瑞香狼毒素的研究和利用越来越广泛，成绩显著。瑞香狼毒素除了在癌症治疗方面的积极贡献外[11-12]，近年来发现瑞香狼毒素可用于治疗高脂血症[13-14]。Jo等[15]采用狼毒治疗特异性皮炎，可有效改善特应性皮肤症状。市售多种抗真菌的中药搽剂，都含有瑞香狼毒素[16]。瑞香狼毒素还被广泛应用于多种有害生物的防治，比如蚜虫、菜青虫、飞蝗、线虫、斑潜蝇以及螨虫[17-19]。

人们在对瑞香狼毒素的药理药性研究中较多关注它积极的一方面，缺乏对其危害性的研究。本实验研究显示，较长时间经口接触低浓度的瑞香狼毒素虽不会引起动物死亡，但会给动物的脏器及其功能带来不利影响，本研究中主要观察了其对胃的影响。

动物实验研究中，体质量作为非特异性的常规观测指标，能大体反映外源性物质对动物机体的毒性效应。本实验研究发现，从染毒第5周开始，中、高剂量组动物体重明显低于正常组。随着染毒时间的延长和剂量的增加，中、高剂量组体重增长率明显下降，尤以高剂量组为甚。结合染毒期间中、高剂量组大鼠出现不同程度被毛光泽暗淡、精神萎靡、活动减少、反应迟钝等症状，表明染毒大鼠出现不同程度的中毒效应。

病理学检查对于组织器质性病变的判断是其它任何方法无法替代的[20]。本研究发现，高剂量组大鼠的胃发生了不同程度的病理组织学改变：胃黏膜上皮缺损，上皮反应性不典型增生，上皮细胞黏蛋白和纤维蛋白的渗出混合，胃腺萎缩，基底部炎细胞浸润，部分被纤维包裹。这说明较长期高浓度瑞香狼毒素染毒的大鼠胃组织结构会遭到破坏，存在反复发作的溃疡，胃腺萎缩。

在反映胃黏膜功能和状态方面，PG水平是一个很重要的参考指标[21]。其中PGI能检测胃泌酸腺细胞功能，胃酸分泌增多时PGI升高，分泌减少或腺体萎缩时PGI则降低；PGII则与胃底粘膜的病变相关性较大，胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增殖都会使其升高；PGI/PGII比值进行性降低，代表胃粘膜发生了萎缩，当降低到一定低值，并且PGI也降低到某个值时，提示有罹患癌症的风险[9]。本研究发现，随着瑞香狼毒素染毒剂量的增加，与对照组相比，PGI的含量逐渐降低，PGⅡ也在降低，在高剂量组降低最明显，同时PGI/PGII比值也在进行性降低，高剂量组最明显，提示胃腺萎缩在进行性加剧，这与病理学检查结果基本一致。

CX43在胃粘膜遭受破坏的早期，作为应激状态下胃粘膜细胞间的快速反应因子，对应激状态下胃粘膜细胞凋亡和增殖产生影响，在维持胃粘膜细胞正常的生理生化功能方面起着重要作用[22]。本研究发现，低剂量组的CX43蛋白含量已经较正常组发生了明显下降，随染毒时间和剂量增加，CX43还在持续下降。说明CX43的反应很灵敏，在蛋白层面是最先被破坏的一类物质，并且随染毒剂量的增加，这种破坏还在加剧。

CX43作为细胞间隙连接的结构蛋白，可以偶联其它细胞，及时将化学信号、电信号、能量物质通过间隙连接迅速流向其它细胞[23]。本实验中，CX43含量的变化，并没有立即引发PGI和PGII的变化，直到高剂量组，PGI、PGII含量和PGI/PGII比值全部发生明显的变化，相关性分析也提示了这一点。说明胃腺体发挥了部分代偿能力。

本实验中设置了恢复组，安排了7 d的恢复期，虽然时间不长，不足以使病理改变发生明显变化，但其PGI、PGII分泌量和CX43蛋白表达量这些随情况的变化能在早期发生改变的指标，与高剂量组比较，也没有发生变化，说明暴露因素虽消除，但之前的暴露在体内发生了蓄积，并且该物质的半衰期较长，这与何华红等[24]研究结果类似。

综上所述，瑞香狼毒素较长期染毒会对大鼠胃组织造成损害，引起广泛性的胃慢性萎缩，这种损害可能与CX43表达被抑制有关，并且瑞香狼毒素可以在机体发生蓄积，对于机体的损害会持续较长一段时间。由此可见，瑞香狼毒这把双刃剑，在使用时一定要注意量和时间的问题，在日常生活中，也要尽量少接触。