王 曦，苍金荣，归巧娣，周 楠，刘宗智（.西安市红会医院关节病院，西安 70054；

2.陕西省人民医院，a.检验科；b.陕西省临检中心；c.药学部；d 骨科，西安710068）

骨关节感染是指细菌、病毒等微生物侵入关节腔内导致的关节炎症，患者多为抵抗力较弱的儿童以及老年人。关节感染最常见的原因是败血症，而外伤、手术、关节附近的软组织感染也是造成关节感染的原因。关节感染临床上分为急性感染性关节炎和慢性感染性关节炎，急性感染性关节炎可由细菌或病毒感染引起，而慢性感染性关节炎可由分枝杆菌、真菌和一些致病性较弱的细菌引起。随着新的诊疗技术应用及实验诊断水平的提高，苛氧菌、少见菌等感染的报道屡见不鲜。本文报道1 例骨关节发生少见的尖端赛多孢菌与偶发分枝杆菌并发感染病例，从病原学诊断和临床治疗过程进行分析，为临床少见病原菌感染诊治提供思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2017年12月在陕西省某三甲医院骨科收治1 例骨关节尖端赛多孢菌与偶发分枝杆菌并发感染病例作为研究对象。患者男性，46 岁，体重60 kg，农民，2 个半月前（2017-9-18）耕地时因旋耕机打伤，致左侧大腿及膝关节内侧软组织损伤，伤口与左膝关节相通，在当地医院行清创缝合术，术后3 周伤口愈合良好，拆线；1 个半月前（2017-10-21），患者左膝关节出现红肿伴有发热，体温38 ℃，外院给予头孢类抗生素对症治疗及关节腔穿刺培养（未培养出细菌），随后行“左膝关节冲洗引流术”，引流后体温恢复正常，但是后期引流欠佳时，体温再次升高。为求进一步诊治以“左膝关节术后感染”收住于骨科（2017-12-01）。入院时查体发现左下肢见膝关节内上方延伸约15 cm至膝关节前方愈合瘢痕，仍留有少许缝线，伤口愈合欠佳，膝关节无明显发红，稍肿胀，皮温略高，左膝关节局部压痛，活动受限，双下肢末梢血运好。

1.2 仪器与试剂 革兰染色液、抗酸染色液、荧光染色液和棉兰染液（贝索）；血平板、麦康凯平板、沙保弱平板和厌氧平板(郑州安图)；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS，美国BD 公司）。

1.3 方法 患者入院后，采集静脉血进行血细胞分析、C 反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率和降钙素原（PCT）等指标检测，同时由骨科医师采用无菌操作抽取关节腔积液，立即送检验科微生物室进行涂片染色（革兰染色、抗酸染色、荧光染色）和培养。具体操作严格按照《全国临床检验操作规程》（第4 版）进行。根据培养结果参考《热病》、《国家抗微生物治疗指南》及临床药师意见进行抗生素治疗。定期复查血细胞检测、肝肾功能及感染指标，及时调整用药。

2 结果

2.1 患者常规检查结果 血细胞分析：白细胞计数7.1×109/L，中性粒细胞百分比66%，红细胞计数4.14×1012/L，血红蛋白119 g/L，血小板计数444×109/L；肝肾功能均正常；其他感染指标：红细胞沉降率85 mm/h，CRP 75.23 mg/L，PCT ＜0.05 ng/mL，T-SPORT 阴性。

2.2 关节液病原学检查

2.2.1 直接涂片检查结果：见图1。患者关节腔引流液外观为脓血性乳糜状液体（图1D）；直接涂片染色的结果：抗酸染色见大量白细胞和抗酸阳性呈柴捆状排列的菌体（图1A）；革兰染色见大量白细胞及真菌菌丝和孢子（图1B）；荧光染色见团状菌丝（图1C）。

图1 关节腔脓液性状及涂片多种染色结果

2.2.2 培养与MALDI-TOF MS 鉴定结果：见图2。关节腔积液接种于血平板、麦康凯平板、沙保弱平板和厌氧平板，分别置于37℃ 和30℃，需氧和厌氧环境培养，逐日观察。培养72h 后，37℃需氧血平板见灰白色丝状真菌大菌落及细小、颗粒样、干燥小菌落（图2A）；30℃沙保弱平板也见灰白色绒毛样大菌落（图2B），尖端赛多孢菌培养物经棉兰染色见尖端赛多孢黏束产孢和环痕产孢（图2C 和图2D）。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）鉴定，真菌为尖端赛多孢菌、细菌为偶发分枝杆菌，见图3。

图2 关节液培养血平板（A）、沙保弱平板（B）菌落形态及尖端赛多孢菌棉兰染色（C，D）

图3 尖端赛多孢菌、偶发分枝杆菌MALDI-TOF MS 鉴定图谱

2.3 临床治疗 临床根据培养鉴定结果和《热病》、《国家抗微生物治疗指南》及临床药师意见进行抗生素治疗。给予左氧氟沙星＋伏立康唑＋阿米卡星静脉滴注、治疗14日，患者左膝关节肿胀明显减轻，左下肢肌力正常、出院。出院医嘱口服左氧氟沙星＋多西环素＋伏立康唑，因患者经济原因中途自行停服伏立康唑后病情复发再次入院。行关节积液穿刺培养报告：尖端赛多孢菌感染。再次清创，继续给予左氧氟沙星＋伏立康唑＋阿米卡星静脉滴注治疗，待症状改善后改左氧氟沙星＋多西环素＋伏立康唑口服，期间查肝功能：ALT 166 U/L，AST 163 U/L，ALP 127 U/L，GGT 165 U/L，考虑联合用药肝功能轻度受损，改口服左氧氟沙星＋复方磺胺甲噁唑＋伏立康唑，直至出院。出院后6月，患者左膝关节肿胀消失，可自行站立行走，复查血细胞分析、CRP，红细胞沉降率及肝肾功能均正常，逐停用所有药物。该患者停药后再无复发。

3 讨论

关节感染是由来源于滑膜或关节周围组织的细菌、真菌或病毒引起的炎症。感染性关节炎的发病率在全球差异较大：在美国，发病率<200/10 万，欧洲国家的发病率较低，在瑞士<5/10万，但在非洲、拉丁美洲和亚洲发病率相对较高。由于很多骨关节感染症状非特异，常常被误认为骨关节病及骨质疏松而忽略。引起骨关节感染主要病原体仍以G＋菌为主，特别是葡萄球菌属细菌[1]。而我国近年的大样本病原学调查中发现骨关节G-菌感染的比例有所升高[2]。随着人工植入物相关感染日渐增多，骨关节感染率逐渐升高，感染病原体多样化，少见菌、苛氧菌引起的感染报告屡见不鲜[3-4]。

分枝杆菌（Mycobacterium）包括：结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌（NTM）和麻风分枝杆菌。目前已报道的NTM 菌种有190 余种，14 个亚种，大部分为寄生菌，少数为条件致病菌。近年来，由NTM 引起的疾病呈快速增多趋势。2016年发表的《非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识》指出[5]：NTM 可引起身体各部位的疾病，但以肺部感染最为常见，约占NTM 感染的90%，其次受累部位有淋巴结、皮肤软组织、骨及全身播散性病变，中枢神经系统、角膜和耳部感染有个案报道。《伯杰氏系统细菌学手册》根据 NTM 生长速度将其分为快速生长型和缓慢生长型，常见的快速生长分枝杆菌（rapidly growingMycobacteria，RGM）29 种，缓慢生长分枝杆菌26 种。RGM 广泛分布于水源、土壤和动物体内，为条件致病菌，可引起免疫低下人群的呼吸道感染或全身播散。肺外感染通常由局部创伤或手术引起。关节腔感染以龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌多见。2020年《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南》[6]（下简称《指南》）首次指出了NTM病发生的危险因素包括宿主因素、药物因素和环境因素。该病患系农民，伤口被土壤污染造成感染，环境因素在疾病发生发展中起重要作用。临床标本分离NTM 一般考虑从无菌部位分离出的NTM 多为致病菌，从非无菌部位分离出的应首先排除标本污染，呼吸道标本还要排除定植。该患者标本系无菌操作下采集，同时多点取材，培养均检见偶发分枝杆菌，涂片也证实有抗酸阳性菌，多考虑为致病菌而非污染菌。为提高抗酸阳性菌的检出率，本研究还做了涂片荧光染色，同样可检见团状菌丝。《指南》中对于快速生长型分枝杆菌，推荐进行常规药敏试验的药物应包括阿米卡星、亚胺培南/西司他丁(仅限于偶发分枝杆菌)、多西环素、氟喹喏酮类药物、磺胺甲嗯唑/甲氧苄啶、头孢西丁、大环内酯类和利奈唑胺等。微孔稀释法是目前CLSI 推荐的药敏方法，但该方法步骤相对复杂，未在临床广泛应用。对于偶发分枝杆菌皮肤、软组织和骨病的推荐治疗策略为：至少采用2 种敏感药物，疗程至少4 个月，骨病患者的疗程至少6 个月，对于病灶广泛、脓肿形成及药物疗效不佳者，可采用外科清创术或异物清除处理。

尖端赛多孢菌是临床较常分离的赛多孢子菌，是波氏假阿利什菌的无性型，在土壤、污水、腐物等受污染的环境中广泛、长期存在。近年发现，尖端赛多孢菌引起的感染大多为深部感染，免疫功能缺陷人群中如艾滋病、器官移植、淋巴瘤、白血病、长期应用糖皮质激素或免疫抑制剂等患者容易并发该菌感染[7-9]，但在免疫功能正常者中也有检出[10]。尖端赛多孢菌可造成肺部、关节、眼部及中枢神经系统等多部位感染，严重时可造成致死性感染。尖端赛多孢菌对两性霉素B、制霉菌素、伊曲康唑和酮康唑等抗真菌药物天然耐药或活性较低，但对伏立康唑较为敏感。目前 CLSI M38-A2 方案尚未有关于尖端赛多孢菌药敏折点的判断标准，同时尚未确定流行病学折点及临床折点。朱信霖[11]查阅文献，参考烟曲霉的6 种抗真菌药流行病学折点进行判断发现：伏立康唑(MIC50=0.25μg/ml；MIC90=0.5μg/ml)和米卡芬净(MIC50=0.25μg/ml；MIC90=0.5μg/ml)抗菌活性最高。本例患者采用伏立康唑治疗有效，但抗真菌治疗周期较长，停药指征严格，前期该患者因为经济原因自行停药后复发，给治疗带来了不必要的麻烦。

本例患者在田间劳动时发生意外感染偶发分枝杆菌和尖端赛多孢菌，这两种病原体均广泛分布在土壤，成为混合感染的共同“媒介”。但目前这两种菌混合感染尚不多见，检出率较低。分析原因可能：①两者均为临床少见菌感染，生长相对较缓慢，菌落较小，容易忽视、漏诊。②基层实验室设备相对落后，人员经验不足、检查流程与操作不规范等。该患者起病初期在当地医院未培养出病原菌，可能与此有关。一些实验室不重视脓液、引流液涂片检测。忽视涂片和培养相结合而造成漏诊。本实验室对标本涂片进行染色后发现：抗酸染色见抗酸阳性呈柴捆状排列之菌体，革兰染色见真菌菌丝，荧光染色见团状菌丝。这为后期菌落观察及鉴定提供依据，提高培养的阳性率，同时缩短了报告时间。另外许多实验室诊断手段如分子诊断技术，如通过分析同源DNA序列组成差异将细菌鉴定至种的水平，是目前菌种鉴定的“金标准”。直接同源基因或序列比较方法、间接同源基因或序列比较方法、二代测序技术、基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱技术广泛应用于大型实验室，大大缩短了鉴定时间，为临床诊治提供依据。但基层实验室这些设备短缺也是造成诊断阳性率低下的原因。

由于目前国内并没有建立或未广泛开展偶发分枝杆菌和尖端赛多孢菌药敏试验标准，我们主要根据《热病》、《国家抗微生物治疗指南》等推荐意见，选择抗生素治疗。考虑到治疗这两种病原体感染需要长期使用抗生素，治疗过程中应密切观察肝毒性、肾毒性等全身性副作用，及时更改治疗方案。该患者使用左氧氟沙星＋多西环素＋伏立康唑一个月后，血清转氨酶浓度升高，考虑是多西环素及伏立康唑常见不良反应，为此在制定第二次出院方案中，选择复方磺胺甲噁唑替换多西环素，以降低肝脏负担。长期用药患者的依从性也很关键，该患者使用伏立康唑治疗30天后自行停药导致治疗失败，再次规范、足疗程治疗8 个月后，真菌才彻底清除。因此，对于长期使用抗生素的患者，加强患者用药依从性，监测药物不良反应，都是提高抗感染治疗的成功率的关键。

总之，对于深部无菌组织及骨关节感染的诊断，首先需重视标本的留取，特别是用药前标本的留取；其次是标本中脓液直接涂片、多种染色方法的镜下找病原菌，能有效、快速找到大致病原菌；第三是分离培养、苛养菌培养、延长培养时间与仔细观察细菌的生长情况，进一步验证直接涂片结果，且为下一步的鉴定提供菌株；第四是新的鉴定方法的使用，如MALDI- TOF MS 技术及基因测序技术的应用等，提高了病原菌的鉴定准确性与时效性；第五是需不断学习新知识，更新理论知识，学习少见菌及罕见菌的用药指南，对指导临床用药治疗提供帮助。最后，敏感药物的足量全程治疗是彻底治愈骨关节感染的关键，否则感染会反复发作。