沈伟兴，汤佳瑾，傅 鹏（上海市市东医院.肾内科；.重症医学科，上海 200438）

原发性免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)肾病是因肾小球系膜区IgA 沉积肾小球引起的病理改变，患者主要表现为血尿、蛋白尿及肾功能损害，病情严重程度不一[1]。资料显示[2]，原发性IgA 肾病占原发性肾小球疾病患者的45%～50%，是引发终末期肾脏病的主要原因之一。目前，原发性IgA 肾病的诊断和病情评估主要依靠肾活检组织病理学及免疫病理分析，而肾活检具有较大的创伤性，易引发出血并发症[3]。目前国内、国际上对原发性IgA 肾病病情严重程度、预后的评价缺少简单、有效的指标，寻找到无需肾穿、简单易得的生物标志物评估IgA 肾病的严重程度及预后成为当前研究热点。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类广泛参与机体生理、病理调控的非编码蛋白质小分子RNA。有研究发现[4-5]，微小RNA 181b(microRNA-181b, miR⁃181b)参与慢性肾脏疾病的病理生理过程，可作为IgA 肾病患者病情及预后评估的标志物之一，但有关IgA 肾病患者miR⁃181b 表达与其病情严重程度及预后的相关性分析仍较为缺乏。本研究回顾性分析了107 例原发性IgA 肾病患者的临床资料，分析血清miR-181b 水平表达及与病情严重程度、预后的相关性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析上海市市东医院2015年6月～2017年11月收治的原发性IgA 肾病患者107 例的临床资料，其中男性72 例、女性35 例；年龄27～63 岁，平均年龄41.26±6.94 岁。

纳入标准：①符合《原发性IgA 肾病诊治循证指南(2016)》[6]中诊断标准：肾脏病理光镜下可见弥漫性系膜增生或局灶节段增生性肾小球肾炎，免疫荧光可见系膜区IgA 或以IgA 为主的免疫复合物沉积。②年龄＞18 岁。③临床资料完善。④完成至少2年随访。

排除标准：①既往有肾活检史、免疫抑制剂应用史者。②非肾脏因素如肿瘤、肝病、系统性红斑狼疮等引起的非原发性IgA 肾病者。

1.2 仪器与试剂 10g/dl 福尔马林；德国Leica DM3000 显微镜；离心机；TRIzol®LS 试剂盒(上海索宝生物)；紫外分光光度计(北京纽比特科技)；反转录试剂盒(上海康朗生物)。

1.3 方法

1.3.1 分组：①病情评估：根据患者肾脏病理学检查结果进行判定和分组：用10g/dl 福尔马林固定肾活检组织标本，石蜡包埋，制成厚度2 μm 的切片，常规进行HE 染色，观察光镜(×200)下肾组织病理变化。根据肾小管间质损害程度将患者分为轻度、中度和重度，其中肾小管间质损害包括肾小管萎缩(肾小管基底膜不规则增厚伴管径减小)、间质炎症(皮质间质内间质炎症细胞增多)、间质纤维化(皮质区细胞外基质增多造成肾小管分离)，分别计0分(无)、1 分(局灶，<50%病理区域受累)、2 分(弥漫，累及≥50%病理区域)，3 项的评分之和为肾小管间质损害评分，在0～6 分。总分0 分或l分者纳入轻度组，2 分者纳入中度组，≥3 分者纳入重度组。②预后评估：患者均通过电话联合门诊复查的形式进行随访，随访2年后进行血肌酐和肾小球滤过率检测。随访终点为复合终点，患者血肌酐水平较基础值升高至少50%或发展为终末期肾病(接受维持性血液透析治疗或肾小球滤过率＜15 ml/(min·1.73m2)或死亡，为预后较差；未出现上述3 项中任一项，为预后良好。

1.3.2 血清miR-181b 水平检测：采用定量逆转录PCR 法测定。抽取肘静脉血10 ml，3 500 r/min，离心15 min 后留取上层血清。加入到TRIzol®LS 试剂盒中提取总RNA，用紫外分光光度计测定总RNA 浓度及纯度。将2 μg 总RNA加至反转录试剂盒中进行反转录反应。所得产物进 行PCR 扩 增，条 件 为95 ℃30 s，60 ℃20 s，72℃20 s，循环40 次。miR-181b 上游引物序列：5’GCGGATCATTCATTGCTGTCG3’，下游引物序列：5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’。以U6 作为内参，内参上游引物序列：5’CTCGCTTCGGCAGCACATA3’，下游引物序列：5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’。受试者血清miR-181b 检测结果采用2-△△Ct表示。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，比较采取独立样本t检验或单因素的方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。相关性采用Spearman相关法。绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic curve, ROC)曲线分析血清miR-181b水平对原发性IgA 肾病疾病严重程度及预后的预测价值。

2 结果

2.1 病情严重程度与血清miR-181b 的相关性 107例原发性IgA 肾病患者中轻度35 例、中度46例、重度26例。轻度、中度和重度患者的血清miR-181b水平分别为(1.47±0.41)×2-△△Ct，(1.89±0.58)×2-△△Ct和(2.69±0.67)×2-△△Ct，经单因素的方差分析差异有统计学意义(F=49.765，P<0.05）。经Spearman 相关分析，病情严重程度与血清miR-181b 呈正相关(r=0.801，P=0.000)，病情越严重，血清miR-181b 水平越高。

2.2 预后与血清miR-181b 的相关性 107 例原发性IgA 肾病患者随访2年后，预后良好88 例、预后较差19 例。预后良好组和预后较差患者的血清miR-181b 水平分别为（1.73±0.52）×2-△△Ct，（2.95±0.74）×2-△△Ct，经独立样本t检验差异有统计学意义(t=5.193，P<0.05)。经Spearman 相关分析，预后与血清miR-181b 水平呈正相关(r=0.494，P=0.000)，预后越差，血清miR-181b 水平越高。

2.3 血清miR-181b 水平对病情严重程度、预后的预测价值 将轻度和中度患者赋值“0”、重度患者赋值“1”，预后良好患者赋值“0”、预后较差患者赋值“1”，血清miR-181b 水平原始数据录入后分别绘制ROC 曲线，结果显示血清miR-181b 预测原发性IgA 肾病病情严重程度的ROC 曲线下面积 为0.886(95%CI：0.717～0.966，P=0.013)。最 佳临界值2.25×2-△△Ct，此时灵敏度为0.892，特异度0.731，见图1。血清miR-181b 预测IgA 肾病预后的ROC 曲线下面积为0.848(95%CI：0.701～0.925，P=0.020)。最佳临界值2.48×2-△△Ct，此时灵敏度为0.873，特异度为0.704，见图2。

图1 血清miR-181b 预测病情严重程度的ROC 曲线

图2 血清miR-181b 预测预后的ROC 曲线

3 讨论

IgA 肾病缺乏特异性症状，患者多表现为无症状血尿、蛋白尿，但也有部分患者无明显症状，直至发展为终末期肾病才被发现[7]。据报道[8]，30 岁以上的IgA 肾病患者中50%在确诊时已发生3 ～5期的慢性肾脏病，其中20%～40%会在后续进一步发展为终末期肾病。研究发现[9-10]，IgA 肾病的发生与异常糖基化IgA1 的形成、血循环免疫复合物沉积、肾小管基底膜增厚、间质炎症和纤维化、肾小管细胞凋亡等多种病理生理有关。

miRNA 是内源非编码RNA，对基因表达具有调节作用，参与各种生物学过程，如代谢、免疫应答、细胞增殖和凋亡等[11]。专家发现[12]，疾病状态下的miRNA 表达谱会发生变化，且可通过靶向途径影响多种疾病包括慢性肾脏疾病的发生和发展。张翠平等[13]的研究表明，儿童原发性肾病综合征患者的尿液外泌体中miR-23b-3p 浓度明显高于健康对照组，且经治疗后降低，可作为儿童原发性肾病综合征辅助诊断和治疗效果监测的潜在指标。吴忠璟[14]的研究认为，糖尿病肾病患者的血清miR-135b 异常升高，且与患者肾脏损伤及预后不良有关。miR-181b 是miRNA 中的其中之一，动物实验发 现[15-16]，特异敲除小鼠的miRNA 酶基因可减缓小鼠肾脏肾小球硬化、蛋白尿和慢性肾衰竭进展，表明miRNA 对肾脏疾病的病理生理过程有重要调节作用。miR-181b 是miR-181 家族成员，参与肾组织损伤过程。国外研究表明[17]，miR-181b 可调控细胞凋亡，从而影响肾脏疾病严重程度。LÜ 等[18]的研究也发现，封闭人近端肾小管上皮细胞内的miR-181b 后，肾小管上皮细胞对药物中毒性肾损伤的抵抗力增强。上述几项研究均表明，miR-181b 在肾脏疾病发病过程中起到重要调控作用。王琳琳等[19]的研究发现，糖尿病肾病患者的血清miR-181b 显著高于2 型糖尿病患者，提示miR-181b 可能参与2型糖尿病患者进展为糖尿病肾病的过程。该研究还进行了相关性分析，发现血清miR-181b 与糖尿病肾病严重程度呈显著相关性，且采用血清miR-181b预测糖尿病肾病的ROC 曲线下面积达0.911，具有较高的诊断效能，提示血清miR-181b 在糖尿病肾病的诊断和病情评估中具有较大价值。

本研究中不同病情严重程度及不同预后患者血清miR-181b 的差异有统计学意义，经Spearman相关分析证实，IgA 肾病严重程度及预后均与血清miR-181b 水平呈显著相关性，病情越严重，预后越差，血清miR-181b 越高。miR-181b 在IgA 肾病发生和进展中的参与和调控机制尚不明确，但有研究指出[20]，miR-181b 可能是通过间接或直接作用对收缩压和尿微量清蛋白/肌酐比值进行调控从而影响IgA 肾病的严重程度与预后，但具体机制仍不明确。基质金属蛋白酶是一组参与细胞外基质降解的肽酶，其中组织金属蛋白酶抑制因子3(tissue inhibitors of metalloproteinases-3, TIMP3) 的3’-UTR具有两个miR-181b 高度保守的同源位点(位点1，2)[21-22]。有动物实验发现[23]，在表达miR-181b 的肝细胞中观察到TIMP3 蛋白水平下降50%左右，而耗尽miR-181b 细胞后，TIMP3 蛋白和RNA 表达水平分别提高约50%和60%。这一结果说明，TIMP3 是miR-181b 的 靶 标，miR-181b 在mRNA和/或蛋白质水平上对TIMP3 表达进行干扰，这也是miR-181b 影响IgA 肾病病情的主要机制，血清miR-181b 水平越高，对TIMP3 的抑制作用越强，对肾脏的损害越重[24]。绘制ROC 曲线发现，当血清miR-181b 分别＞2.25×2-△△Ct和2.48×2-△△Ct时对重度IgA 肾病、较差预后的预测价值最高。另外，其与活体肾组织病理检查相比创伤性大幅减轻，操作简便，临床适用性较高，可通过血清检测为病情和预后评估提供参考。

本研究局限性：①为单中心回顾性研究，且集中在横断面，缺乏队列研究，未能全面考虑随访结果的影响因素，可能造成预后的有关结论存在偏倚。②随访时间相对较短，而IgA 肾病属于慢性肾脏疾病，部分患者到达研究终点的时间可能较长，因此到达终点事件的人数较少，可能造成结果偏倚，有待后续进一步延长随访时间对结论进行验证。

综上所述，血清miR-181b 水平与IgA 肾病病情严重程度及预后均呈显著相关性，血清miR-181b越高，病情越重，预后越差。积极检测IgA 肾病患者血清miR-181b 水平可为患者的病情及预后评估提供参考。