一株沼泽红假单胞菌发酵培养基优化、放大及应用

2021-12-09杨传伦张心青马春峰王秀芝李佳明杨丹丹

天津农业科学 2021年11期

杨传伦张心青马春峰王秀芝李佳明杨丹丹

摘要：為了提高沼泽红假单胞菌菌剂发酵水平，并将菌剂应用于生产，本研究运用单因素试验对其培养温度、pH、接种量、光照发酵培养条件进行优化，并筛选了其培养基需要的最佳碳源、氮源、微量元素及无机盐，然后运用Plackett-Burman试验获得了影响发酵菌量的显著因素，最后通过最陡爬坡试验确定了最佳培养基配方，并将优化配方进行20 L放大培养，同时开展了水产养殖水体改良试验。结果表明，其优化培养条件为温度33 ℃，pH7.0，初期培养接种量20%～40%，光照强度4 000 lx;优化培养基配方为柠檬酸1.0 g·L-1，牛肉膏1.8 g·L-1，酵母膏1.0 g·L-1，蛋白胨1.0 g·L-1，乙酸钠1.0 g·L-1，硫酸镁0.4 g·L-1，硫酸亚铁8.0 mg·L-1，氯化钙0.15 g·L-1，磷酸二氢钾0.2 g·L-1，VB6 0.21 mg·L-1，复合无机盐0.5 mL·L-1，pH 7.0。此条件下可获得沼泽红假单胞菌菌量8.65×109 CFU·mL-1，作为生态养殖的优良改良剂，明显提高了水产养殖产量。

关键词：沼泽红假单胞菌;培养基优化;Plackett-Burman设计;水产养殖

中图分类号：Q815 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.11.003

Optimization， Amplification and Application of Fermentation Medium for Rhodopseudomonas palustris

YANG Chuanlun1， ZHANG Xinqing1，MA Chunfeng1，WANG Xiuzhi1， LI Jiaming2，YANG Dandan

（1.Chambroad Chemical Industry Research Institute Co.，Ltd.， Binzhou， Shandong 256500， China;2.Shandong Chambroad Environmental Protectiom Material Co.，Ltd.， Binzhou， Shandong 256500， China）

Abstract： To improve the fermentation level of Rhodopseudomonas palustris and apply the agent to production， the experiment was conducted from the following aspects. Firstly， single factor experiment was used to optimize the fermentation conditions of temperature， pH， inoculum amount and light， and screen the optimal carbon， nitrogen， trace elements and inorganic salts by single factor experiment. Secondly， the Plackett Burman test was used to obtain the significant factors affecting the amount of fermentation bacteria. Finally， the best medium formula was determined through the steepest climbing test. The optimized formula was cultured in 20 L scale-up;meanwhile， the aquaculture water body improvement test was carried out. The results showed that the optimum culture conditions was temperature 33 ℃， pH 7.0， initial curture inoculation amount 20%-40%， light intensity 4 000 lx. The optimized medium formula was citric acid 1.0 g·L-1， beef extract 1.8 g·L-1， yeast extract 1.0 g·L-1， peptone1.0 g·L-1， sodium acetate1.0 g·L-1， magnesium sulfate 0.4 g·L-1， ferrous sulfate 8.0 mg·L-1， calcium chloride 0.15 g·L-1， potassium dihydrogen phosphate 0.2 g·L-1， VB6 0.21 mg·L-1， compound inorganic salt 0.5 mL·L-1， pH 7.0.Under the above condition， the bacterial count of Rhodopseudomonas palustris could reach 8.65×109 CFU·mL-1， which significantly increased the yield of aquaculture as an excellent improver of ecological aquaculture.

Key words： Rhodopseudomonas palustris; medium optimization; Plackett Burman design; aquaculture

沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）属于红螺菌科红假单胞菌属，是一种不产氧光合细菌，是自然界广泛存在的一类具有光能合成体系的原核生物[1-3]。在厌氧光照、好氧光照和好氧黑暗环境中都能很好生长，它不仅能进行光合作用，固定、同化和降解有机物及某些有毒物质，如降低COD、 BOD、氨氮量，降低硫化氢，还可以增加溶氧，改善水质，是养殖水体生物修复领域研常用的菌种[4-8]。沼泽红假单胞菌富含各种生物活性蛋白、泛酸、叶酸和多种维生素，可作为饲料添加剂用于经济动物的养殖，是农业部《饲料添加剂品种目录》规定可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种[9-10]。

目前，沼泽红假单胞菌的应用主要集中在水产养殖方面，如刘小燕等[11]研究了沼泽红假单胞菌 R-3 对草鱼养殖及水质的影响，发现沼泽红假单胞菌可改善养殖水质，提高草鱼免疫能力和成活率，促进草鱼生长;文刚等[12]研究了沼泽红假单胞菌 R-3 去除水体中氨氮的特性，表明沼泽红假单胞菌具有高效去除殖水体中氨氮的能力;许志强等[13]研究了沼泽红假单胞菌在暗纹东方鲀育苗上的应用，表明水体中投放沼泽红假单胞菌，能显著的提高暗纹东方鲀仔鱼育成率以及生长。此外，沼泽红假单胞菌还有在动物饲料中的应用，如提高生长性能和改善血液生理生化指标[14-15]，油田废水处理，降低焦油中酚类，去除重金属离子等环保上面的应用[16-18];以及其他方面的应用，如对植物、菌类、藻类等生长的促进作用[19-21]。

本研究所述沼泽红假单胞菌同样具有降低水体氨氮、亚硝酸盐等优化物质，有效增加水体溶解氧，提高水产养殖的产量的作用。本研究重点对该泽红假单胞菌发酵培养基优化，提高菌剂发酵水平，并应用于实际生产，评价其实际应用效果，旨在为水产养殖行业提供一种优良菌剂、改善水质条件、促进水产行业增产增收提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源沼泽红假单胞菌：黄河三角洲京博化工研究院有限公司生物育种研究室保藏。

1.1.2 培养基初始发酵培养基：柠檬酸3.5 g·L-1，牛肉膏3.3 g·L-1，硫酸镁0.5 g·L-1，硫酸亚铁2 mg·L-1，复合无机盐0.5 mL·L-1（EDTA 0.5 g·L-1，硫酸锌0.01 g·L-1，硼酸0.03 g·L-1，氯化锰0.003 g·L-1，氯化钙0.02 g·L-1，氯化铜0.001 g·L-1，钼酸钠0.003 g·L-1），pH 7.0～7.4。

1.1.3 试验仪器 HS-800D恒温水槽：太仓市利达试验设备有限公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂;722型可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司;精密pH计：上海雷磁仪器厂;HC-2518R高速冷冻离心机：科大创新有限公司中佳分公司;超净工作台：苏州净化公司;Leica DM IL LED倒置显微镜：徕卡显微系统贸易有限公司;智能光照培养箱：上海捷呈实验仪器有限公司;SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 菌体浓度检测方法（1）活菌计数法：显微镜直接计数法。

（2）分光光度法：采用722型可见分光光度计，以灭菌后的液体培养基为空白对照，将新鲜发酵培养液稀释至合适倍数，于660 nm 处测定发酵液OD660值。

1.2.2 试验设计（1）沼泽红假单胞菌发酵培养条件筛选。以初始发酵配方作为基础培养基，采用单因素试验对温度（28，30，33，35，37 ℃）、初始pH值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）、接种量（5%，10%，15%，20%，25%）、光照强度（1 000，2 000，3 000，4 000，5 000 lx）等沼泽红假单胞菌發酵培养条件进行筛选。具体操作方法：试验选用500 mL透光塑料瓶进行培养，装液量90%，初始pH 7.0，接种量20%，白炽灯光照4 000 lx，温度33 ℃，静止密封培养，每隔8 h摇晃一次塑料瓶，培养周期5 d，检测660 nm波长下菌剂稀释10倍的OD660值。其中，各培养条件的单因素试验均以相关的因素设置替换操作方法中的相应条件即可，其他条件不变。

（2）沼泽红假单胞菌发酵培基优化。以菌量为衡量标准，以初始发酵配方作为基础培养基，通过单因素试验筛选最佳碳源（葡萄糖、蔗糖、碳酸钠、乙酸钠、DL-苹果酸、丁二酸钠、甘油），氮源（酵母膏、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、尿素），无机盐及微量元素（0.1 g·L-1硫酸锰、氯化钙、碳酸钙，0.2 g·L-1磷酸二氢钾，0.3 g·L-1磷酸氢二钾，2 mg·L-1硫酸铜，0.2 mg·L-1VB6，0.1mg·L-1生物素），其中碳源试验以所选碳源等浓度替代基础培养基中的柠檬酸，氮源试验以所选氮源等浓度替代基础培养基中的牛肉膏，微量元素试验则在基础培养集中按各自设计的浓度直接添加。

依据基础培养基及单因素试验，选择10个因素（柠檬酸、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、乙酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙、磷酸二氢钾、VB6）设计12组的Plackett-Burman试验，每个因素取高低 2 个水平，详见表1，12个组合详见表2。再根据Plackett-Burman试验结果，选择硫酸亚铁、VB6、牛肉膏3个因素设计最陡爬坡试验（表4）。

单因素、Plackett-Burman和最陡爬坡试验均选用500 mL透光塑料进行培养，装液量90%，接种量20%，初始pH 7.0，白炽灯光照4 000 lx，温度33 ℃，静止密封培养，每隔8 h摇晃一次塑料瓶，培养周期5 d，显微镜直接计数法检测菌量。

1.2.3 沼泽红假单胞菌20 L放大验证对前述试验获得的优化配方进行20 L放大验证，培养步骤如下。

（1）菌种活化：将液体菌种接种在透光性较好的试管（25 mm×180 mm）中活化，装液量90%，接種量40%，初始pH 7.0，白炽灯光照4 000 lx，温度33 ℃，静止密封培养，培养时间4 d，培养期间每隔8 h摇晃一次塑料瓶，使沼泽红假单胞菌充分接受光照，利于生长，4 d后明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色。

（2）一级种子培养：一级种子选用500 mL透光塑料瓶进行培养，装液量90%，接种量30%，初始pH 7.0，白炽灯光照4 000 lx，温度33 ℃，静止密封培养，培养时间3 d，培养期间每隔8 h摇晃一次塑料瓶，3 d后明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色。

（3）20 L扩大培养：生产光合细菌选用20 L透光塑料桶，白炽灯光照强度4 000 lx，控制温度33 ℃，密封，装液量90%，接种量10%，明显有菌剂固有的特殊气味，颜色由浅红、红、逐渐变为了红褐色，跟踪7 d，检测OD660及菌量生长曲线。

1.2.4 沼泽红假单胞菌菌剂应用将最优配方生产的沼泽红假单胞菌菌剂应用于南美白对虾，跟踪虾塘生长理化指标及南美白对虾的生长情况。试验于山东省东营市利津县某养殖户虾塘开展，两个虾塘面积均为0.5 hm2，水深均为2 m。采用扩大培养的水产养殖专用沼泽红假单胞菌剂对试验组虾塘水体进行改良，对照组虾塘作未用该菌剂处理，其它条件均一致。改良方法：2019年8月10日上午8：00第1次泼洒菌剂;2019年8月25日上午8：00第2次泼洒菌剂，每次菌剂施用量为15.0 L。

2 结果与分析

2.1 沼泽红假单胞菌发酵培养条件筛选

2.1.1 温度由图1可知，在温度为28～37 ℃范围内，OD660呈现先增加后降低的趋势，至33 ℃时达到最大值且显著高于其他处理。综合而言，最佳温度选择33 ℃。

2.1.2 初始pH 由图2可知，在pH为6.0～8.0的范围内，OD660呈先增加后降低的趋势，至pH 7.0达到最大值，但其与pH 6.5和pH 7.5时差异不显著。综合而言，最佳pH值选择7.0。

2.1.3 接种量由图3可知，随着接种量的增加，OD600先增加后趋于稳定，至接种量20%时达到最大值，但在接种量10%～25%的各处理之间差异均未达显著水平，说明大于等于10%的接种量基本不会影响最终菌量。在后期20 L及400 L的放大培养中发现，增大接种量，可以避免发酵过程中的染菌风险，缩短发酵周期，特别是在初期菌种培养阶段，接种量宜在20%～40%，在逐级放大的最后可将接种量降至10%～20%。

2.1.4 光照强度由图4可知，光照强度1 000～5 000 lx，OD600呈先增加后趋于稳定的趋势，当大于等于3 000 lx时，其对菌体生长影响不显著，为了使效果稳定，故最佳光照选择4 000 lx。

2.2 沼泽红假单胞菌发酵培基优化

2.2.1 碳源筛选由图5可知，培养3 d，沼泽红假单胞菌发酵效果表现为柠檬酸效果最佳，其次是甘油、乙酸钠、DL-苹果酸;培养5 d，沼泽红假单胞菌发酵效果表现最佳仍为柠檬酸，其次是乙酸钠。综合而言，柠檬酸作为碳源较好。

2.2.2 氮源筛选由图6可知，沼泽红假单胞菌有机氮源的利用要显著优于无机氮源，较好的有机氮源依次是牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨。

2.2.3 无机盐及微量元素添加由图7可知，与对照（无添加）相比较，添加VB6、氯化钙、磷酸二氢钾均能使菌体显著增加，磷酸氢二钾、生物素、碳酸钙作用不显著，而硫酸铜则表现出显著抑制菌体生长的现象，可能和不同微量元素的作用机制及添加浓度有关。

2.2.4 Plackett-Burman试验由Plackett-Burman试验结果如表2所示，采用Design Expert8.0.6软件进行分析得到最佳拟合方程为：

菌量=6.50-0.094×A-0.15×B-0.11×C+0.028×D-0.056×E+0.014×F+0.65×G-0.036×H+0.036×J+0.35×K

由分析结果可知，此模型的P值为0.029 2<0.05，说明此模型显著，具有统计学意义，其决定系数为0.999 9，校正系数为0.998 4，也能说明该模型的合理性。由表3可知，各因子对产光合细菌发酵水平影响表现为硫酸亚铁（G）>VB6（J）>牛肉膏（B）>酵母膏（C）>柠檬酸（A）>氯化钙（H）>乙酸钠（E）>磷酸二氢钾（I）>蛋白胨（D）>硫酸镁（F），对菌量有显著影响（P<0.05）的因素为硫酸亚铁、VB6、牛肉膏，其中硫酸亚铁、VB6是正效应，牛肉膏是负效应，其他因素的变化对产菌量影响不显著，根据选择硫酸亚铁、VB6、牛肉膏进行下一步最陡爬坡试验。

2.2.5 最陡爬坡试验由表4可知，随着硫酸亚铁及VB6浓度的增加，牛肉膏浓度的降低，菌量呈现先增加后降低的趋势，且发酵液颜色呈现逐级加深的现象，这和硫酸亚铁的添加量有密切的关系，综合衡量菌量及发酵菌剂颜色，选择试验组5为最佳配方，菌量可达到8.65×109 CFU·mL-1，该配方为柠檬酸1.0 g·L-1，牛肉膏1.8 g·L-1，酵母膏1.0 g·L-1，蛋白胨1.0 g·L-1，乙酸钠1.0 g·L-1，硫酸镁0.4 g·L-1，硫酸亚铁8.0 mg·L-1，氯化钙0.15 g·L-1，磷酸二氢钾0.2 g·L-1，VB6 0.21 mg·L-1，复合无机盐0.5 mL·L-1，pH 7.0。

2.3 沼泽红假单胞菌20 L放大验证

由图8可知，在最优配方的20 L放大试验中，发酵7 d菌量可达到8.96×109 CFU·mL-1，其与OD660之间的关系：菌量=151.25×OD660（R2=0.987 0，P=0.032<0.05）。

2.4 沼泽红假单胞菌菌剂在水产养殖中的应用

由表5可知，养殖池塘使用沼泽红假单胞菌菌剂后显著降低了池塘的氨氮和亚硝酸盐含量，至使用30 d时，二者分别较使用前降低了99.4%，99.0%，同时水中溶解氧由显著增加了54.3%，有效改善了水体环境。同时，通过一个月的时间，两次施用该菌剂，使得南美白对虾快速生长，平均体重由（25.0±0.10） g·尾-1增加至（52.6±0.11）g·尾-1，增加了110.4%;相比于没有经过该菌剂处理的对照组（体重增加80.4%）增幅提高了30个百分点。由此可见，运用该配方培养的沼泽红假单胞菌菌剂可有效减低水体的氨氮、亚硫酸盐，减轻毒性，并增加水中溶解氧的量，有效改善水体环境，提高水产养殖产量，可作为生态养殖的优良改良剂。

3 结论与讨论

关于沼泽红假单胞菌的发酵配方优化，已有较多文献报道但所获菌量偏低，如刘德海等[22]在沼泽红假单胞菌发酵培养条件优化研究中，最终菌量为5.6×108 CFU·mL-1;刘昆等[23]在光合细菌生产配方的优化研究中，活菌数可达12.5×108 CFU·mL-1;幸晶晶等[24]在沼泽红假单胞菌培养基的优化研究中，OD660值可达到2.186。并且已有的沼泽红假单胞菌的发酵配方优化文献试验方法相对单一，且对菌剂的放大培养及应用涉及较少。如夏兵兵等[25]在沼泽红假单胞菌发酵条件的响应面优化研究中，仅对其发酵条件进行优化;杜冰等[26]在沼泽红假单胞菌发酵培养的研究中，仅使用单因素试验对培养条件及配方进行分析;钱森和等[27]在紫色非硫光合细菌培养基条件优化的研究中，仅对其配方优化，未涉及菌剂的放大培养及应用。

针对以上研究的不足，本研究首先运用单因素试验对温度、pH、接种量、光照发酵培养条件进行优化;然后筛选最佳的碳源、氮源、微量元素及无机盐;最后运用Plackett-Burman设计及最陡爬坡试验确定最佳配方。通过本研究最终使沼泽红假单胞菌菌剂发酵菌量达到8.65×109 CFU·mL-1，远超过现有已有相关报道的生产水平，最终确定其配方为柠檬酸1.0 g·L-1，牛肉膏1.8 g·L-1，酵母膏1.0 g·L-1，蛋白胨1.0 g·L-1，乙酸鈉1.0 g·L-1，硫酸镁0.4 g·L-1，硫酸亚铁8.0 mg·L-1，氯化钙0.15 g·L-1，磷酸二氢钾0.2 g·L-1，VB6 0.21 mg·L-1，复合无机盐0.5 mL·L-1，pH 7.0。

此外，本研究还将优化配方进行20 L放大培养，并将沼泽红假单胞菌菌剂应用于水产养殖，取得了良好的效果，为沼泽红假单胞菌大规模应用提供了技术支持。然而，针对大型连续的生产，还需作进一步的探究与改良。

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