周建忠++吴伟

摘 要：当前我国的高密度水产养殖模式造成底质环境恶化，不利于水产养殖的可持续发展，因此研究水产养殖的底质控制和改良技术显得非常重要和迫切。本文在参考其他方法的基础上，通过利用微生物和酶来转化池塘底泥和降低有机碳的含量，以有效控制集约化养殖池塘中的碳源污染。研究显示，采用0.625 mg·cm-3的用量，无论是微生物单一菌种或单一酶，其在10 d内均对底泥的TOC有一定的降低作用。但微生物和酶的组合效果显著好于单一微生物或酶，其中地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、淀粉酶和纤维素酶按1∶1∶2∶1比例的组合效果最佳，对底泥TOC的降低率高达23.8%。在温度和DO适宜的条件下，上述配方的菌酶制剂按6.75 kg·hm-2的用量，30 d内可降低池塘底泥厚度0.47 cm，底泥中有机碳含量的降低率达21.82%。研究表明，利用菌酶复合制剂对集约化养殖池塘进行处理，可减少底泥的产生量，降低有机碳的含量，减少碳排放，且菌酶复合制剂的每公顷实际使用成本仅为825元，具有良好的环境效益、经济效益和社会效益，有一定的推广价值。

关键词：微生物；酶；水产养殖；底质；总有机碳；控制

中图分类号：Q939.96 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.006

池塘养殖是我国淡水养殖的传统方式，在我国的渔业经济中占主导地位。但是，为了获取更高的经济利益，养殖者常采用高密度、高投饵的养殖方式，使得养殖生物的代谢产物、残饵等大量有机物质沉积于池塘底部，造成底质环境恶化。大量有机底质的存在，不但增加了池塘的碳源，又易引发二次污染，严重影响水域生态环境，不利于池塘养殖的可持续发展[1-4]。因此，有必要研究池塘养殖的底质控制技术和环境改良技术，对养殖池塘生态环境进行净化和优化，以实现池塘养殖的可持续发展。

近年来，我国池塘养殖水体底质环境的控制和修复的各项技术发展很快，出现了诸如物理技术、化学技术、微生态技术及综合技术等多种技术[5-8]。但应用微生物菌酶技术来控制养殖水体中底泥及有机碳的研究尚未有报道。为了探索好氧—兼性细菌组合复配生物酶来转化池塘底泥和降低有机碳的功能，本试验在已完成相关菌株筛选的基础上，以池塘养殖罗非鱼为主要养殖模式，研究利用微生物和酶来控制有机碳的碳汇养殖方式，为合理有效控制集约化养殖池塘中的碳源提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验池塘及养殖生物 试验池塘采用某水产养殖公司的标准化鱼类养殖池塘，共8个池塘，其中对照池1个，试验池3个，设2组平行。每个池塘的面积为6 670 m2，水深1.5 m。试验于2014年6月30日开始，7月29日结束，共计30 d，试验期间平均水温为（29.3±1.8） ℃。每个池塘中养殖的品种均为奥利亚罗非鱼（Oreochromisco aureus），各池塘中养殖鱼类的规格、数量基本一致。每667 m2放养的罗非鱼数量为2 500尾，规格为每尾50 g左右。试验期间养殖管理措施一致且不换水。

1.1.2 微生物菌株及生物酶 试验用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心提供；淀粉酶（5 000 U·g-1）、纤维素酶（（20 000 U·g-1）由无锡杰能科生物技术有限公司提供。

1.1.3 仪器与试剂 所用化学试剂为硫酸、硫酸汞、重铬酸钾、葡萄糖、氯化钠等，均为分析纯，国药集团上海试剂厂产品；牛肉膏、蛋白胨等生化试剂为北京陆桥技术有限责任公司产品。

所用仪器为pH计、ZHJH-1214双面气流式无菌工作台（上海智诚公司），Autoclave SS-325型全自动高压灭菌器（TOMY公司），MIR-153型高低温恒温培养箱（SANYO公司），ZHWY 200B恒温振荡摇床（上海智诚公司）， AL204电子分析天平（METTLER-TECEDO公司），冰箱（三星电子公司），721分光光度计（上海第三分析分析仪器厂），7530紫外分光光度计（Agilent公司），Nikon显微镜，全自动控温型养殖系统等。

1.2 方 法

1.2.1 微生物菌粉的制作 地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均采用肉汤培养基（蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1 水1 L，调节pH值 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min，冷却备用）培养。从试管斜面上取一环菌苔，接种到10 mL灭菌的肉汤液体培养基中，于30 ℃、100 r·min-1摇床上培养24 h，培养至对数生长期，再将该菌液接入已灭菌的250 mL肉汤培养基中，同样条件下培养24～48 h，当活菌数>5×109 CFU·mL-1时，将菌液按重量比1∶4的比例吸附于超细膨润土粉上，低温干燥后成为菌粉，活菌含量不低于109 CFU·g-1。

1.2.2 微生物菌及生物酶组合的筛选 将养殖池塘的底泥取回实验室，放入全自动控温型养殖系统（内含规格为100 cm×60 cm×50 cm的玻璃水族箱32个）的水族箱中，铺满水族箱底部，泥层厚度为（8.0±0.3） cm。同时用池塘水将底泥盖住，上覆水层厚度为（5.0±0.2） cm，DO为（4.2±0.3） mg·L-1，环境温度为（28±0.5） ℃。为防止试验时水分的蒸发，每3 d用池塘水补足上覆水深度。将微生物菌、生物酶单独试验，并进行不同的组合，设置了15个不同的处理组，详见表1，同时设置不添加菌和酶的对照组。试验设置2个平行，研究菌、酶及其复配物对底泥中有机碳的转化情况，筛选最适宜的菌—酶组合底质净化剂。

1.2.3 微生物菌及生物酶复配对养殖水体底泥的转化及有机碳的影响 根据1.2.2中所筛选出的最适菌酶组合，将其应用于养殖生产池塘，探究其底质净化的能力。为保证菌酶制剂能顺利抵达并停留在底质层面，将菌酶组合压制成直径为3 cm的片剂，每片的平均质量为15 g。试验设置3个剂量组，用量为4.50 ，6.75，9.00 kg·hm-2，同时设1个对照组。试验设2个平行，分别在试验开始后的0， 15， 30 d，对不同剂量微生物菌—酶组合处理后的养殖池塘底泥进行取样测试，了解养殖池塘底泥中有机碳的动态变化情况。同时进行水体底泥厚度的分析，了解水体底质环境质量的变动情况，以便寻求最佳的微生物菌酶处理方式。试验期间底质有机碳的分析方法采用HJ615—2011所规定的重铬酸钾氧化—分光光度法[9]，底泥厚度的测量采用下探尺法直接测量。

1.2.4 数据统计与分析 试验数据使用SPSS 19.0软件进行差异显著性分析，P<0.05表明差异显著，P<0.01表明差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同菌酶组合对池塘底质有机碳的转化

参考目前养殖底质净化剂的使用情况，试验采用每个水族箱中添加30 g菌粉、酶或菌酶组合的用量（相当于0.625 mg·cm-3泥的用量），应用不同的菌、酶及其组合来处理养殖底泥，10 d后测定底泥中有机碳的含量，了解微生物或酶及其组合对池塘底泥的转化情况，具体情况见表1。

由表1可见，在试验期间，同样使用0.625 mg·cm-3的量处理池塘底泥，由于采用的处理物质不同，10 d后底泥中的总有机碳含量明显不同，TOC的去除率相差较大。与对照组相比，无论是微生物单一菌种或单一酶，其在10 d内均对底泥的TOC有一定的去除作用，去除率在4.0%～7.4%。但微生物菌与菌组合或酶与酶的组合效果显著好于单一微生物或酶，其对TOC的去除率为10.0%～15.9%。而微生物菌与生物酶的组合效果则更优异，其不同组合对TOC的去除效果在10.5%～23.8%，特别是地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌+淀粉酶+纤维素酶（按1∶1∶2∶1组合）的组合效果最佳，对底泥TOC的去除率高达23.8%。这主要与菌酶的不同性质有密切关系。地衣芽孢杆菌是兼性细菌，好氧、微氧条件下均可生长，枯草芽孢杆菌是好氧细菌[10]，故其两者组合具有在不同DO水平下的作用效果，并且比好氧条件下效果更好。本试验中因底泥层较薄，上覆水较浅，DO相对较高，为（4.2±0.3） mg·L-1，故效果显著。同时，由于养殖池塘底质受饲料残留影响较大，残饵中碳水化合物（糖类）的含量高达62%[11]，故淀粉酶的效果较好。因本试验是在底泥离开池塘的条件下开展的，仅针对微生物—酶的效果筛选，故尚需在池塘中进行验证试验。

2.2 微生物菌粉及生物酶复配对养殖水体底泥的转化及有机碳的影响

采用地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌+淀粉酶+纤维素酶（按1∶1∶2∶1比例）的组合，按4.50，6.75，9.00 kg·hm-2的处理用量处理养殖水体中的底泥30 d，每隔15 d取样分析养殖池塘底泥的厚度及有机碳TOC的含量，考察微生物—酶组合在控制养殖池塘底泥有机碳中的应用效果。不同试验组的池塘底质环境情况见图1和图2。

由图1和图2可见，将菌酶复合制剂按不同的用量加入养殖池塘后，随着使用剂量的增加，水体底泥中的有机碳含量在下降，导致了底泥厚度的降低。其中4.50 kg·hm-2试验组的效果明显不如另外2个试验组，但6.75 kg·hm-2和9.00 kg·hm-2试验组的效果并无显著性差异。考虑到经济有效性，选择菌酶制剂的用量以6.75 kg·hm-2为宜。在温度和DO适宜的条件下，6.75 kg·hm-2试验组经30 d的试验，可降低池塘底泥厚度0.47 cm，底泥中有机碳的去除率达21.82%，对控制池塘底泥的发生及碳素的释放具有显著的功效。

微生物和酶的作用需要有一定的温度和DO作保证，本试验的水温维持在28～31 ℃，底层水体的DO水平在3.2～3.8 mg·L-1间，满足了不同特性微生物的生长和酶的催化活性，故对底泥及TOC的控制效果较好。

因本试验是在养殖池塘中进行，无法随意地控制DO，因此对限制微生物和酶作用效果的最低DO水平无法评估，需要在以后的研究中加以完善。

2.3 菌酶复合制剂的经济效益分析

为使本研究的研究成果具有推广价值，故对使用菌酶复合制剂的经济效益进行分析和评估。上述试验表明，用于处理池塘底泥污染的菌酶制剂的适宜用量为6.75 kg·hm-2，30 d内具有较显著的效果。如果每30 d使用1次，1个养殖季节（以6个月计）1公顷水面的池塘用量为40.5 kg。根据实际的比例，其中淀粉酶为16.2 kg、纤维素酶8.1 kg、地衣芽孢杆菌8.1 kg 、枯草芽孢杆菌8.1 kg 。其中的主要成本来自2个酶，淀粉酶的价格为每28元·kg-1，纤维素酶为35元·kg-1。而菌粉成本相对较低，仅为5元·kg-1。故菌酶复合制剂在一个养殖季节中的实际使用成本仅为825元·hm-2，远低于目前的化学性底质改良剂使用成本。

试验结果表明，利用菌酶复合制剂对集约化养殖池塘进行处理，可减少底泥的产生量，降低有机碳的含量，减少碳排放，具有良好的环境效益、经济效益和社会效益，有一定的推广价值。

3 结 论

（1）采用0.625 mg·cm-3的用量，应用不同的菌酶组合处理养殖底泥，10 d后测定底泥中有机碳的含量。与对照组相比，无论是微生物单一菌种或单一酶，其在10 d内均对底泥的TOC有一定的去除作用。但微生物和酶的组合效果显著好于单一微生物或酶，其中地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌+淀粉酶+纤维素酶（按1∶1∶2∶1比例）的组合效果最佳，对底泥TOC的去除率高达23.8%。

（2）采用地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌+淀粉酶+纤维素酶（按1∶1∶2∶1比例）的组合，按4.50，6.75，9.00 kg·hm-2的处理用量处理养殖水体中的底泥30 d，随着使用剂量的增加，水体底泥中的有机碳含量在下降，导致了底泥厚度的降低。菌酶制剂的用量以6.75 kg·hm-2为宜。在温度和DO适宜的条件下，6.75 kg·hm-2试验组经30 d的试验，可降低池塘底泥厚度0.47 cm，与对照组相比TOC的去除率达21.82%，对控制池塘底泥的发生及碳素的释放具有显著的功效。

（3）利用菌酶复合制剂对集约化养殖池塘进行处理，可减少底泥的产生量，降低有机碳的含量，减少碳排放，且菌酶复合制剂的实际使用成本仅为825元·hm-2，具有良好的环境效益、经济效益和社会效益，有一定的推广价值。

参考文献：

[1] 吴伟，范立民.水产养殖环境的污染及其控制对策[J].中国农业科技导报，2014，16（2）：26-34

[2] 安鑫龙，周启星.水产养殖自身污染及其生物修复技术[J].环境污染治理技术与设备，2006，7（9）：1-6.

[3] 王建平，陈吉刚，斯烈钢，等.水产养殖自身污染及其防治的探讨[J].浙江海洋学院学报：自然科学版 ，2008， 27（2）：192-196.

[4] Smith V H，Tilman G D，Nekola J C. Eutrophication：impacts of excess nutrient inputs on freshwater， marine and terrestrial ecosystems[J].Environ Poll，1999，100：179-196.

[5] 邹玉霞，辛福言，李秋芬，等.对虾养殖池环境修复作用菌固定化的研究[J].海洋科学，2004，28（8）：5-8，75.

[6] 苏跃朋，马甡，董双林. 施加有机降解菌制剂虾池底质中有机碳和总氮的变化[J].海洋科学，2003，27（1）：61-64.

[7] 王彦波，查龙应，许梓荣.微生态制剂改善对虾养殖池塘底质的效果[J].应用生态学报，2006，17（9）：1 765-1 767.

[8] 田昌凤，刘兴国，张拥军，等.池塘底质改良机的研制[J].上海水产大学学报，2013，22（4）：616-622.

[9] 大连市环境监测中心.HJ 615—2011 土壤 有机碳的测定 重铬酸钾氧化-分光光度法[S].北京：中国环境科学出版社，2011：1-4.

[10] 呼慧娟，范小燕，周琳，等.不同氧需求特性菌株在模拟肠道厌氧条件下的增殖[J].饲料工业，2011，32（20）：38-41.

[11] 蔡继晗，李凯，郑向勇，等.水产养殖对环境的影响及其防治对策分析[J].水产养殖，2010，31（5）：32-38.