蓝海琴，朱婷婷，李旭丽，郑星耀，许佳华，赖勇勇，朱斐

(浙江农林大学 动物科技学院动物医学院，浙江 杭州 311300)

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)引发的白斑综合征是对甲壳动物具有较高致死率，并且具有很强传染性的疾病[1]，严重威胁着世界上经济虾类养殖的安全。自从1993年我国暴发此病以来，虾类养殖业受到沉重打击，几乎所有养殖虾类皆可被感染。早期WSSV的毒力较强，被感染的虾3～10 d内死亡率可达100%[2]，但是近年来该病毒发生了较大程度的变异，更多呈现出潜伏感染的趋势。克氏原螯虾的养殖价值可观，其养殖产业发展日益蓬勃，但由于养殖水体出现污染、养殖密度不断提高以及饲料污染等原因[1-3]，淡水养殖的克氏原螯虾也开始流行WSSV。本研究通过获取浙江省各个地区克氏原螯虾的WSSV检出率及病毒拷贝数，研究影响浙江省克氏原螯虾WSSV病毒检出率及病毒拷贝数的因素，为养殖提供一些可行性建议。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用克氏原螯虾采购自杭州、湖州、温州、丽水4地的养殖场。每月各地各采样15份，5个月共75份螯虾样本。聚合酶链式反应(PCR)扩增所用引物等由上海生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 WSSV的PCR检测

病毒DNA根据试剂盒操作步骤进行提取，提取出的DNA样品利用引物(Forward：5′-CTTTCAC TCTTTCGGTCGTG-3′，Reverse：5′-TTCTGCCCCAC AGTCACTTC-3′)进行PCR反应扩增囊膜蛋白VP28基因片段。PCR反应体系：DNA模板(WSSV DNA)1 μL；10×PCR扩增缓冲液5 μL；MgCl2(25 mmol·L-1)3 μL；dNTPs 1 μL；上游引物(20 mmol·L-1)1 μL；下游引物(20 mmol·L-1)1 μL；Taq酶1 μL。加超纯水至总体积为50 μL(以上都在冰上操作)，置于PCR仪内进行扩增。PCR程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，运行30个循环；72 ℃ 10 min；10 ℃ 5 min。PCR产物加入琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后用Immage master VDS成像系统检测目的条带。……