滕元姬 陈志鸿

【关键词】 CRISPR-Cas系统;基因编辑技术;宫颈癌

中图分类号：R737.3   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.10.009

CRISPR是细菌和古生菌经过亿万年的长期进化而产生出的一种适应性免疫防御系统，它能够通过crRNAs直接降解外源入侵DNA，从而保护自身结构的完整性和连续性。CRISPR-Cas基因编辑是一种由RNA引导的基因编辑技术，与锌指核酶、转录因子核酶等传统基因编辑技术相比，具有成本低、效益高、灵活性强、易于操作等优点[1]。宫颈癌是全球第四大常见女性恶性肿瘤，每年有超过50万女性被确诊。宫颈癌在我国发病率仅次于乳腺癌。近年来，其发病年龄呈年轻化的发展趋势，有研究建议将宫颈癌的筛查年龄提前到35岁以前[2～3]。现通过CRISPR-Cas基因编辑技术围绕宫颈癌的建模、早期筛查、耐药性靶点治疗等相关研究进展做一综述。

1 CRISPR-Cas系统概况

1.1 CRISPR-Cas系统的发展

CRISPR-Cas最早是在1987年由日本研究人员在测定Escherichia coli碱性磷酸酶同工酶转化基因IAP核苷酸序列时，在IAP 3端发现的以32个核苷酸为间隔，5组29个高度同源核苷酸序列排列而成的直接重复序列[4]。2002年Jansen等人通过silico分析技术进一步证实了这类重复DNA序列家族只存在于古生菌和细菌中。为了更好地定义这类直接重复的DNA序列，将它们正式命名为成簇规则间隔的短回文重复序列CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）[5]。2012年，研究人员通过引入RNA成功介导CRISPR-Cas9对目标基因组进行编辑，使CRISPR-Cas系统揭开了第三代基因编辑技术的序幕，并被Science评为十项重大科技成果之一[6]。近年来，CRISPR-Cas基因编辑技术越来越多地被用于医药生物科技、工业微生物领域等各个领域[7]。

1.2 CRISPR-Cas系统的作用机制

CRISPR系统根据其Cas蛋白基因含量不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型。其中CRISPR-Cas9系统是研究得相对成熟且使用最为广泛的[8]。CRISPR-Cas9系统的免疫防御过程可分为适应、表达、干扰三个阶段[9]。在适应阶段，当细菌和古生菌识别到有噬菌体、病毒或外源性质粒入侵时，Cas1和Cas2通过原间隔区相邻基因序列（PAM）的识别将入侵体的同源DNA短片段整合到CRISPR前导序列与第一个重复序列之间，完成对入侵体的适应过程[10]。在表达阶段，含有入侵體DNA片段和PAM间隔区的CRISPR位点被转录产生一个新的CRISPR RNA前体（pre-crRNA），在CRISPR内切酶的作用下将pre-crRNA加工为成熟crRNA[11]。进而对入侵体的核酸进行切割。在I型系统中，crRNA将Cas蛋白复合物引导至与间隔区的入侵体互补的DNA靶点基因序列上，由CRISPR-Cas3负责对入侵的DNA进行切割[12]。在Ⅱ型系统中，携带crRNA的CRISPR-Cas9 在PAM26的识别下能直接针对入侵的DNA进行切割。细菌和古生菌便是通过此系统破坏入侵体DNA结构从而保存自身结构和系统的完整性。

1.3 CRISPR-Cas系统的广泛应用

CRISPR近年来已经成为基因组编辑革命的代名词。特别是RNA引导的核酸内切酶CRISPR-Cas9系统，其在基础研究和基因编辑治疗方法中的应用前景备受关注[13]。CRISPR-Cas系统是高效且易于编程、成本较低的核酸靶向工具，用途不仅局限于医学科学研究和疾病诊断治疗、药物开发，也可用于细菌菌种分型、细菌耐药性、自身免疫、自身靶向细胞调控等研究[14]，还可用于动植物的精确育种和工业微生物工程体系[15]。可以说，CRISPR-Cas系统已经被运用到人类生活的方方面面。

2 CRISPR-Cas系统在宫颈癌早期筛查诊断中的应用前景

目前，国内使用最广泛的宫颈癌早期筛查主要手段包括宫颈液基细胞学检查（TCT）和HPV-DNA检测。但两种方法都有其技术上的局限性，如TCT对样本质量要求较高，取样质量对检测结果有较大影响，容易导致漏诊发生[16]。HPV-DNA成品化试剂不能全面覆盖所有HR-HPV检测类型，而且检测技术要求高，检测成本高，不适于做全面推广筛查[17]。CRISPR-Cas9/sgRNA系统在DNA检测和分型方面具有巨大潜力，该系统对靶点识别的特异性高，对同源DNA的检测和分型有很大帮助，因此，Cas9/sgRNA系统在DNA检测中的应用日益受到广泛关注[18]。例如，该系统已被用于美国和非洲的寨卡病毒检测和分型[19]。另外，Cas9/sgRNA还被用来标记血液游离DNA中与疾病相关的突变基因，以便通过PCR技术更容易地检测到它们[20]。同样，若将CRISPR-Cas9/sgRNA系统引入宫颈癌早期筛查，设计E6/E7+CRISPR-Cas9引物探针对女性血液样本进行PCR扩增技术检测筛查，随着PCR技术的日趋成熟，相信CRISPR-Cas基因编辑技术一定能成为宫颈癌早期筛查的一个新的、适宜推广的、高效精准的检测手段[21]。ZHANG等人在研究中开发了Cas9/sgRNA分型PCR检测技术（ctPCR3.0），通过在qPCR反应中直接用Cas9/sgRNA对目标DNA进行切割，可以一步完成对目标基因的检测和分型。他们通过检测HPV各种基因类型，特别是临床标本中的HPV类型，充分验证了这项新技术的高可靠、特异性和灵敏性[22]。

3 CRISPR-Cas系统在构建宫颈癌模型中的应用

E6和E7病毒癌蛋白是HPV的早期启动子。E6、E7在病毒复制过程中起着非常重要的作用，负责复制早期蛋白的表达，它可整合人宿主基底上皮细胞DNA中引起P53和PRB功能失调导致鳞状上皮细胞分化周期紊乱[23]。E6和E7活性增加可以刺激细胞生长，抑制分化，导致染色体结构不稳定，从而导致肿瘤的发生[24]。因此，选择性地剔除宿主细胞中的入侵性外源基因，特别是E6、E7基因，对预防和治疗宫颈癌有重大意义。CHENG等人[25]成功构建hCas9-EGFP和E6-gRNA-RFP质粒，制备了携带有E6-gRNA和Cas9质粒的HPV16假型病毒，通过含有E6-gRNA和Cas9质粒的HPV-16假型病毒转染SiHa细胞并成功表达E6-gRNA，E6-gRNA+CRISPR-Cas9转染的SiHa细胞，其E6 mRNA和蛋白水平均明显下调，增殖和迁移能力受到抑制，CRISPR-Cas9能够有效地完成对靶基因E6的切割。结果表明利用HPV假型病毒介导的CRISPR/Cas9系统敲除E6基因具有消除HPV感染、抑制HPV相关肿瘤生长的潜在作用[26]。这些发现为预防和治疗HPV感染的疾病，特别是与HPV相关的肿瘤提供了新的治疗策略。

4 CRISPR-Cas系統于宫颈癌治疗耐药性的研究

肿瘤细胞对治疗药物产生耐药性是癌症治疗面临的主要问题，具有多重耐药性是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的主要机制[27]。如何剔除肿瘤细胞的耐药基因，使肿瘤细胞重新获得对药物的敏感性，可成为治疗方案的一个突破口。CRISPR-Cas9系统在细菌耐药性方面的研究应用已经是近年的研究热点[14]。例如，李培思[28]研究团队建立了一种单质粒介导靶向mcr-1基因的 CRISPR-Cas9系统，能有效并特异性消除黏菌素耐药Escherichia coli中的mcr-1基因，恢复其对黏菌素的敏感性。可见，构建靶向耐药基因的CRISPR-Cas9系统能从根源上解除耐药基因，阻断耐药基因的复制传代，重新恢复细胞对药物的敏感性[29]。2015年，有学者运用 CRISPR-dCas9系统针对人体2万多个基因设计70 290个sgRNA，构成人全基因组CRISPR-dCas9激活细胞文库[30]。KARIMIAN运用CRISPR-Cas9系统特性切割肺癌患者的表皮生长因子受体（EGFR）突变基因，纠正其治疗耐药性[31]。类似的策略也运用在卵巢癌患者的ER或HER2突变中，SgRNA+CRISPR-Cas9系统被设计为针对ER或HER2突变外显子中的特定序列来修复突变，破坏其耐药功能结构域，使肿瘤细胞失去获得性耐药[32]。有研究者将CRISPR激活系统引入黑色素瘤细胞中，与促进黑色素瘤细胞抵抗BRAF抑制剂PLX-4720耐药激活基因BCAR3共同作用于ERK信号通路下游和上游调控靶点参与耐药机制调控[33]。同样，宫颈癌主要是由HR-PHV病毒引起的，PHV癌蛋白E6、E7高度表达诱导正常细胞发生恶性病变[25]。CDDP是目前临床上治疗宫颈癌最有效的抗癌药物，但其耐药性的出现严重阻碍了宫颈癌的给药治疗[23]。有研究表明，E6/E7+CRISPR-Cas9与CDDP共同作用于肿瘤细胞，显著抑制了细胞的体外生长和促进肿瘤细胞凋亡，这提示了HPVE6/E7+CRISPR-Cas9可以作为CDDP的增敏剂而发挥作用，两者联合治疗可以明显改善宫颈癌患者的预后，鼓励进一步研究HPVE6/E7+CRISPR-Cas9与其他临床化疗药物的相关性和协同作用，为宫颈癌的治疗提供新的选择[34]。

5 CRISPR-Cas系统面临的挑战与希望

CRISPR-Cas系统极大地促进了精准的基因组靶向编辑操作技术，并以各种方式广泛应用于临床癌症治疗，为癌症治疗开辟了新的途径[35]。但不可否认的是CRISPR-Cas系统作为一种新型的基因编辑工具，其自身也存在一定的问题，如编辑细胞的适应性、编辑效率、传递方法和潜在的非靶向效应等[36]。如何降低操作过程中的脱靶率，成了更好利用该系统进行基因编辑的关键因素[37]。有研究提出，降低CRISPR-Cas9介导的脱靶风险可能的方法包括使用配对的Cas-nickaes（Cas尼克酶）、更短的Protspace互补区短链gRNA和高保真Cas核酸内切酶，以及修饰Cas9蛋白以改变PAM特性或增标靶DNA识别也可以用来减少脱靶效应，从而增强靶向特异性[38～39]。另外，科研工作者在医学研究中必须谨慎使用CRISPR系统，避免类似“基因编辑婴儿事件”再次发生[40]。但是，尽管存在一些挑战，但CRISPR-Cas9技术作为一种强大的基因编辑技术，具有巨大的自身潜力和广阔的运用前景[36]。相信随着CRISPR-Cas9技术的不断进步和创新，有望提高临床疾病治疗的安全性和有效性，给患者带来希望。

参 考 文 献

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（收稿日期：2021-02-15 修回日期：2021-03-16）

（编辑：梁明佩）