王彩霞

(宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004)

黄褐斑又称“肝斑”“黧黑斑”，是一种好发于女性颜面部且治疗困难的色素增多性皮肤病〔1〕。皮损为黄褐色或深褐色斑片，常对称分布于面颊部、颧部，呈蝴蝶形，或累及口、鼻、前额和颏部呈不规则形状〔2〕。本病病程长，病情顽固，属难治性皮肤病，对患者生理、心理、精神等方面造成严重影响〔3〕。其主要致病因素为内分泌紊乱、日晒、情绪、遗传、化妆品及长期口服避孕药等，其他危险因素包括甲状腺疾病、光毒性药物、抗癫痫药物等〔4〕。美肤散为自拟方是宁夏医科大学附属回医(中医)院中医美容科外敷治疗黄褐斑的经验用方，临床应用疗效显著。本研究主要探讨美肤散对黄褐斑的治疗作用及机制，为其临床应用提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1药物 美肤散组成为丹参、当归、白附子、僵蚕、黄芪等(均由宁夏医科大学附属回医中医院中药房提供)。将上述中药材清洗干净，烘干后按照重量配比混合在一起，然后将混合的中草药研磨成粉末，并将粉末过150～300目筛，收集过筛后的粉末并搅拌均匀，再用钴60照射灭菌，得到美肤散中药面膜粉，将其密封保存待用。每次实验时将美肤散用市售纯牛奶调配成1.2 g/ml美肤散混悬液，供小鼠外敷使用。黄体酮注射液：每支10 mg/ml(山西晋新双鹤药业有限责任公司)，维生素C注射液(徐州莱恩药业有限公司)，浓度：0.5 g/2 ml。

1.2动物 C57BL/6J小鼠40只，清洁级，雌性，体重(20±2)g，均由宁夏医科大学实验动物中心提供。

1.3试剂 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂褐质(LF)、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(均购于南京建成生物工程研究所)，酪氨酸酶(TYR)测定试剂盒(由南京建成生物工程有限公司代购)。鼠抗人单克隆抗体HMB45即用型试剂盒(购于福建迈新公司)。

1.4仪器 EB-160/FE紫外灯(美国spectronics公司)，DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机(上海将来实验设备有限公司)，DK-420S型三用恒温水箱(上海精宏实验设备有限公司)，TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂)，FL45荧光分光光度计(美国PE公司)，722分光光度计(上海第三分析仪器厂)，ELx808全自动酶标仪(美国佰腾)。

1.5动物分组与造模 将小鼠按数字分组法分为空白组、模型组、阳性对照组(维生素C组)、美肤散组，每组10只。采用黄体酮注射液联合中波紫外线照射的方法进行造模。实验前24 h，各组小鼠均用8%硫化钠(Na2S)水溶液脱去小鼠背部短毛(面积约2.0 cm×2.0 cm)，脱毛后用温水清洗干净，实验期间每周脱毛1次。除空白组外，其余各组均以波长为280～320 nm的中波紫外线(UVB)每日照射小鼠背部皮肤1次，照射时间为1 h，光源距离小鼠20 cm，连续照射30 d。同时，除空白组外，其余各组均肌肉注射黄体酮注射液20 mg/(kg·d)，而空白组肌肉注射灭菌注射用水2 ml/(kg·d)。各组均注射于小鼠大腿根部，每日1次，两腿交替进行，连续30 d。

1.6给药方法 造模同时，美肤散组外敷美肤散混悬液，阳性对照组外涂维生素C水溶液，空白组及模型组外涂灭菌注射用水。以上治疗每日1次，每次30 min，连续给药30 d。

1.7生化指标检测 于第30天末次给药2 h后将所有小鼠断颈处死，迅速取其经紫外线照射部位皮肤0.5 g左右，冰浴中制成10%组织匀浆，再将10%匀浆离心，取上清液，并严格按照试剂盒提供的方法，测定皮肤和肝脏组织中SOD活性及MDA、酪氨酸酶(TYR)、LF水平。

1.8皮肤黑色素细胞的病理形态学观察 分别取小鼠照射部位皮肤组织1块(1 cm×1 cm)，用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片后，再经脱蜡至水、抗原修复，用HMB45(黑素瘤)为第一抗体，采用免疫组化技术显示表皮中的黑素颗粒，观察黑色素细胞在表皮中的分布及分泌功能情况。

1.9统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1美肤散皮肤组织中黑色素细胞数、TYR、MDA、LF及 SOD 活性的影响 与空白组比较，模型组皮肤组织中黑色素细胞数目、TYR、MDA及LF含量均显著增加，SOD显著降低(P<0.01)，提示造模成功；与模型组比较，美肤散组明显减少黑色素细胞数目，明显降低皮肤中TYR、MDA及LF含量(P<0.01)，同时提高皮肤中 SOD 活性(P<0.05)，见表1。

表1 各组黑色素细胞数、TYR、MDA、LF含量及SOD活性的影响

2.2美肤散对黄褐斑肝脏组织中TYR、MDA、LF及 SOD 活性的影响 与空白组比较，模型组小鼠肝脏组织中TYR、MDA及LF含量均显著增加；SOD显著降低(P<0.001)；与模型组比较，美肤散组明显降低皮肤中TYR、MDA及LF含量(P<0.01)，同时显著提高皮肤中 SOD 活性(P<0.05)，见表1。

3 讨 论

黄褐斑是一种临床上常见的慢性面部色素代谢障碍性皮肤病〔5〕。现代医学认为，黄褐斑是由人体黑色素生成异常导致，其发病机制非常复杂，可能的相关因素也较多，目前认为人体内分泌失调、紫外线照射、遗传因素是其主要因素〔4〕。而氧化与抗氧化之间的平衡失调，是黄褐斑公认的主要诱因〔6〕。当机体内脂质过氧化增强，氧自由基生成过量时，体内的SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化物质就会增加，从而清除多余的氧自由基，使机体内氧化与抗氧化处于动态平衡状态〔7〕。黄褐斑患者体内氧化应激系统大多出现障碍，氧自由基生成过多和抗氧化酶活性降低均可造成生物膜的脂质过氧化，使膜的结构和功能受损而引发黄褐斑〔8〕。因此，抗氧化也是黄褐斑治疗的重要机制之一。

黑色素生成过多是黄褐斑形成的根本原因〔4〕。黑色素主要由人体皮肤表皮基底层的黑色素细胞产生，其含量和分布决定了皮肤的颜色〔9〕。但黑色素在基底层的异常蓄积会造成色素沉着过度从而引起黄褐斑、雀斑和老年斑等，严重影响人们的生活质量〔10〕。研究表明，TYR在黑色素生物合成中扮演着重要角色，它是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中，是酪氨酸和多巴向黑色素转变过程中的关键酶、限速酶，它的活性大小决定着黑色素合成的数量〔11,12〕。因此，通过抑制TYR活性，即可阻断黑色素生物合成反应链，有效防止黑色素的过度沉积，从而起到抑制黄褐斑的作用〔13,14〕。

美肤散为自拟方，是根据黄褐斑的皮损特点，选用具有活血养血、祛斑化瘀、美容养颜、补血消斑功效的中药组成的复方。本方由丹参、当归、白附子、僵蚕、黄芪等中药组成。其中丹参活血祛瘀，养血凉血〔15〕；当归养血活血，润泽亮肤〔16〕；白附子解毒散结，增白淡斑〔17〕。僵蚕疏风散热，驻颜祛斑；黄芪补气益血，美白润肤〔18〕。将上述药物打磨配置后应用于黄褐斑患者，疗效显著。本实验结果显示，美肤散局部外敷可降低黄褐斑模型小鼠皮肤和肝脏组织中TYR、MDA及LF含量，增强SOD活性，同时可以明显减少黄褐斑小鼠皮肤组织中黑色素细胞数目。提示美肤散对黄褐斑模型小鼠具有较好的治疗作用，其作用机制可能与抑制黑色素细胞的增殖和TYR的活性，增强机体抗氧化能力有关。