矫淑芹 林爱庆 李雪婷

(烟台市牟平区中医医院 1脑病科，山东 烟台 264100；2心血管病科)

缺血性脑卒中将会导致局部脑组织及其功能的损害，其损害程度与缺血的时间长短有关〔1〕。因此，及时恢复脑组织的供血对缺血性脑卒中病人的恢复至关重要。但是再灌注可诱发神经元细胞的凋亡，引起神经元损伤。因此，预防再灌注引起的神经元损伤成为缺血性脑卒中研究领域的热点之一。目前，再灌注引起的神经元损伤的机制尚未得到充分阐明，需要进一步寻找关键的调控因子，为临床的治疗和药物研发提供分子靶点。

微小RNA(miRNAs)是一种长度为22个核苷酸左右的单链内源性的RNA分子〔2，3〕。研究发现，miRNAs在调控脑血管疾病的发生、发展及恢复中发挥重要的调控作用，是一种潜在的缺血性脑卒中治疗靶点〔4～6〕。有研究发现，急性脑缺血小鼠恢复供血后3 h，血液中miR-448的表达量就达到峰值，说明miR-448可能在脑缺血再灌注过程中发挥重要的调控作用〔7〕。另外，降低miR-448的表达可降低缺血再灌注引起的脊髓神经元的凋亡〔8〕。尽管如此，尚无报道探讨miR-448在脑缺血再灌注引起的神经元凋亡中的作用。本文拟通过构建氧葡萄糖剥夺/再恢复(OGDR)神经母细胞瘤细胞模型，分析miR-448在OGDR诱导的细胞凋亡的作用及潜在机制，探讨miR-448在脑缺血再灌注引起的神经元细胞损伤中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1实验材料及主要试剂 神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。Trizol和SYBR GREEN qPCR Super Mix购自Invitrogen。CCK8试剂盒和膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天。Western印迹一抗及二抗购自Abcam。miR-448抑制剂(inhibitor)及阴性对照(NC)由苏州吉玛基因合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养及传代 SH-SY5Y细胞10%胎牛血清完全培养基中置于常氧条件下培养(培养箱参数设置：95%的空气，5%的CO2，37℃)。传代首先用0.25%胰酶室温下消化1 min，并在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，2～3 d传代1 次。根据细胞的生长情况，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2细胞转染及OGDR模型构建 细胞转染：按照Lipo6000TM转染试剂的说明进行操作。OGDR模型构建培养条件：待细胞贴壁后，将完全培养基换成Hank平衡盐溶液(HBSS)，并置于缺氧培养箱中培养(培养箱参数设置：94%的N2，1%的O2和5%的CO2，37℃)；培养4 h后，将HBSS换成完全培养基，并在常氧条件下培养24 h。

1.2.3细胞分组 正常培养组：按照SH-SY5Y细胞正常培养条件培养。OGDR组：待细胞贴壁后，按照OGDR模型构建条件培养。转染试剂+正常培养组(Ⅰ组)：添加转染试剂后，按照SH-SY5Y细胞正常培养条件培养。NC预转染+OGDR组(Ⅱ组)：使用转染试剂转染NC后24 h，按照OGDR模型构建条件培养。miR-448 inhibitor预转染+OGDR组(Ⅲ组)：使用转染试剂转染miR-448 inhibitor后24 h，按照OGDR模型构建条件培养。

1.2.4荧光定量PCR 按照Trizol常规方法提取各组细胞的总RNA；经过去基因组和纯度鉴定后，进行RNA浓度测定；按照miRNA茎环引物的说明，取1 μg 总RNA，使用M-MLV逆转录进行逆转；按照SYBR GREEN qPCR Super Mix的说明进行PCR反应。使用U6小核RNA作为内参，按照2-ΔΔCt的方法计算miR-448的相对表达量。miR-448的正向引物和反向引物序列分别为5′ TCGGCAGGTTGCATATGTAGGA 3′和5′ CTCAACTGGTGTCGTGGA 3′。U6小核RNA的正向引物和反向引物序列分别为5′ CTCGCTTCGGCAGCACA 3′ 和5′ AAC GCTTCACGAATTTGCGT 3′。

1.2.5CCK8检测 取对数期生长的细胞，接种在96孔板；按照细胞分组所述的方法进行细胞处理；待处理结束后，每孔加入10 μl CCK8溶液；培养箱内孵育4 h；用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数期生长的细胞，接种在6孔板；按照细胞分组所述的方法进行细胞处理；待处理结束后，胰酶消化细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min，4℃离心5 min收集细胞。加入100 μl 1×结合缓冲液重悬细胞；加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，轻轻混匀；避光、室温反应10～15 min；加入400 μl 1×结合缓冲液，混匀后放置于冰上，随即流式细胞仪检测，BD FACSDiva 8.0.1软件分析实验结果。

1.2.7Western印迹分析 取对数期生长的细胞，接种在6孔板；按照细胞分组所述的方法进行细胞处理；待处理结束后，加入RIPA裂解液提取总蛋白。根据蛋白浓度测定的结果，计算每孔的蛋白上样量；每孔加入30 μg的总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离总蛋白；半干法转膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)；5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入稀释好的二抗4℃孵育过夜；第2天，TBST缓冲液洗去多余的一抗，加入稀释好的二抗，室温孵育40 min后，TBST缓冲液洗去多余的二抗；暗室内，加入电化学发光(ECL)液，使用X-ray曝光。利用Image Pro-Plus6.0软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)分析蛋白的相对表达量。

1.2.8统计分析 采用SPSS19.0进行独立t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-448在OGDR处理的SH-SY5Y细胞中的表达 OGDR组细胞存活率为(50.46±4.54)%，与正常培养组相比有统计学意义〔(100.00±2.00)%;t=17.3，P<0.000 1〕，说明模型构建成功。荧光定量PCR的结果显示，miR-448的表达水平在OGDR组的SH-SY5Y细胞中显著升高(8.49±0.97 vs 1.00±0.06;t=13.41，P=0.000 2)，表达水平为正常组的8.49倍。

2.2miR-448 inhibitor抑制miR-448表达验证 与NC组相比，miR-448 inhibitor组SH-SY5Y细胞中miR-448的表达水平显著降低(0.99±0.06 vs 0.17±0.07;t=15.66，P<0.000 1)。miR-448 inhibitor对SH-SY5Y细胞中miR-448表达的抑制率为83%，可以用于后续实验。

2.3抑制miR-448表达对OGDR处理的SH-SY5Y细胞活力的影响 与Ⅰ组相比，Ⅱ组的细胞存活率显著降低〔(100.00±4.00)% vs (50.13±5.63)%,P<0.05〕。Ⅲ组的细胞存活率显著高于Ⅱ组〔(70.25±2.00)%,P<0.05〕。

2.4抑制miR-448表达对OGDR处理的SH-SY5Y细胞凋亡水平的影响 如图1，与Ⅰ组相比，Ⅱ组的细胞凋亡率显著升高〔(6.50±0.79)% vs (38.11±4.26)%,P<0.05〕，Ⅲ组细胞凋亡率显著低于Ⅱ组〔(16.67±1.62)%,P<0.05〕。与Ⅰ组相比，Ⅱ组Bax表达水平明显升高，Bcl-2的表达明显降低。与Ⅱ组相比，Ⅲ组的细胞中Bax的表达水平明显降低，Bcl-2的表达明显升高。见表1、图1、图2。

表1 各组Bax、Bcl-2、SIRT1蛋白表达

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平

图2 Western印迹检测Bax和Bcl-2的表达

2.5miR-448靶基因SIRT1在OGDR处理的SH-SY5Y细胞中的表达 如图3所示，与正常培养组(3.15±0.06)相比，miR-448靶基因SIRT1在OGDR组中的表达水平明显降低(1.54±0.11，P<0.05)。

图3 Western印迹检测OGDR组SH-SY5Y细胞中miR-448靶基因SIRT1的表达水平结果

2.6抑制miR-448表达对OGDR处理的SH-SY5Y细胞中miR-448靶基因SIRT1表达的影响 如图4所示，与Ⅰ组相比，Ⅱ组miR-448靶基因SIRT1的表达水平明显降低。与Ⅱ组相比，Ⅲ组miR-448靶基因SIRT1的表达水平明显升高。见表1、图4。

图4 Western印迹检测抑制miR-448表达对OGDR处理的SH-SY5Y细胞中miR-448靶基因SIRT1表达的影响

3 讨 论

作为内源性非编码RNA的一种，miRNAs在脑血管疾病及神经系统疾病的发生发展中发挥重要的作用〔4，9〕。如let-7、miR-224-3p和miR-155在脑缺血再灌注引起的神经元细胞损伤中发挥重要的调控作用〔10～12〕。但miRNAs家族庞大，仍有众多的miRNAs的功能尚未得到充分的阐明。本研究发现，miR-448在OGDR处理的SH-SY5Y细胞中明显高表达。SH-SY5Y细胞是人神经母细胞瘤来源的细胞系，常被用来体外模拟神经细胞的缺血再灌注〔13，14〕。OGDR常被用来体外模拟脑缺血再灌注。因此，推测miR-448可能在脑缺血再灌注引起的神经元细胞损伤中发挥调控作用。

本研究发现降低miR-448的表达可以减少OGDR引起的SH-SY5Y细胞死亡，降低miR-448的表达可以抑制OGDR引起的SH-SY5Y细胞凋亡。本研究结果提示，miR-448可能促进脑缺血再灌注引起的神经元细胞损伤，抑制miR-448的表达可能成为治疗脑缺血再灌注损伤的新方向。虽然目前没有关于miR-448在脑缺血再灌注损伤中发挥调控作用的报道，但其在脊髓缺血/再灌注损伤中的作用〔8〕可支持本研究的结论。Wang等〔8〕发现，miR-448在缺血再灌注损伤模型大鼠的脊髓组织和缺氧诱导的神经细胞中高表达，且下调miR-448可抑制神经细胞凋亡，改善缺血再灌注损伤模型大鼠的神经功能。另外，有研究发现，急性脑缺血小鼠恢复供血后3 h，血液中miR-448的表达量就达到峰值〔7〕。因此，这些结果支持本研究的结论，即miR-448可能在脑缺血再灌注过程中发挥重要的调控作用，抑制miR-448的表达可能成为治疗脑缺血再灌注损伤的新方向。

miRNAs通过与mRNA的3′非编码区(3′-UTR)结合靶向调控靶mRNA的翻译或者参与靶mRNA的降解，进而参与多种疾病及生理过程的调节〔2，4，9，15〕。因此，鉴定miRNAs的靶基因对阐明miRNAs的调控机制至关重要。Wang等〔8〕研究发现，miR-448通过靶向 SIRT1参与调控脊髓缺血/再灌注引起的损伤。SIRT1是高度保守的去乙酰化酶家族成员，对多种因素引起的神经元损伤发挥保护作用。如SIRT1参与保护剪切力诱导的神经元损伤、缺氧诱导的神经损伤和缺血再灌注诱导神经损伤〔8，16～18〕。基于SIRT1在神经损伤保护中的重要作用，推测miR-448可能通过靶向SIRT1调节脑缺血再灌注引起的神经元细胞损伤。本研究结果说明，miR-448可以在OGDR处理的SH-SY5Y细胞中靶向调控SIRT1，miR-448可能通过靶向调控SIRT1参与脑缺血再灌注引起的神经元细胞损伤过程。但这尚属于推论，仍需进一步的体内实验加以证明。另外，miR-448潜在的及已经证明的靶基因有多个，miR-448是否通过其他靶基因参与脑缺血再灌注引起的神经元细胞损伤过程？仍需进一步的实验加以证明。

综上所述，OGDR处理引起miR-448在SH-SY5Y细胞中高表达，降低miR-448的表达可以抑制OGDR引起的SH-SY5Y细胞凋亡和死亡，说明降低miR-448的表达可以减轻OGDR引起的SH-SY5Y细胞损伤。鉴于OGDR处理人神经母细胞瘤模型常用来模拟神经细胞的缺血再灌注，因此，推测miR-448可能在脑缺血再灌注过程中发挥重要的调控作用，抑制miR-448的表达可能成为治疗脑缺血再灌注损伤的新方向。