谷少华 刘巧方 李向南

(1新乡市中心医院中医产科，河南 新乡 453500；2河南师范大学化学化工学院)

卵巢癌发病率与死亡率逐年增高，严重危害患者身体健康及生活质量，目前临床主要采用手术与放化疗结合的方式治疗卵巢癌，具有一定治疗效果，但长期化疗导致患者出现不同程度的不良反应〔1，2〕。既往研究显示从天然物质中提取有效成分用于治疗恶性肿瘤成为研究重点，部分中药已被证实可通过影响肿瘤细胞周期及细胞凋亡等过程而发挥抗肿瘤作用，但中药的抗肿瘤作用机制尚未完全阐明〔3〕。研究表明白芷对胃癌、直肠癌、食管癌、卵巢癌等恶性肿瘤具有一定的抑制作用〔4～6〕。但白芷对卵巢癌细胞生物行为及机制尚未可知。长链非编码RNA(LncRNA)异常表达与肿瘤发生发展密切相关，研究表明长链非编码RNA SBF2-AS1(LncRNA SBF2-AS1)在肺癌中上调表达，并可促进肿瘤细胞增殖〔7〕。但SBF2-AS1对卵巢癌细胞生物学行为的影响尚未可知。starBase预测显示微小RNA-329-3p(miR-329-3p)可能是SBF2-AS1的靶基因，研究表明miR-329-3p在宫颈癌中表达下调，miR-329-3p过表达可抑制细胞增殖〔8〕。但白芷对SBF2-AS1/miR-329-3p轴的调控作用及其对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响尚未可知。本研究主要探讨白芷提取物对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响，分析其对SBF2-AS1/miR-329-3p轴的调控作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 白芷提取物购自陕西嘉禾生物科技股份有限公司。卵巢癌细胞 A2780购自上海联迈生物工程有限公司。DMEM培养基与0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司；蛋白提取试剂盒购自陕西碧云天生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒购自 美国Sigma公司；SBF2-AS1小干扰RNA(si-SBF2-AS1)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-329-3p模拟物(mimics)、阴性对照 mimic NC 序列(miR-NC)购自广州锐博生物科技有限公司；pcDNA3.1购自上海索宝生物科技有限公司；Lipofectamine2000与Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Primescript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(反转录试剂盒)购自日本TaKaRa公司；SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自沈阳万类生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；双荧光素酶报告基因载体及活性检测试剂盒购自美国Promega公司；兔抗人细胞周期蛋白(Cyclin)D1、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、P21、Bcl-2相关X蛋白(Bax)一抗购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1实验处理与分组 卵巢癌A2780细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养，待细胞稳定传代后，收集对数生长期A2780细胞，用不同浓度(4 mg/ml、8 mg/ml、16 mg/ml)的白芷提取物处理A2780细胞，实验分组：对照组(未经任何处理的细胞)、白芷-L组(用终浓度为4 mg/ml的白芷提取物处理细胞24 h)、白芷-M组(用终浓度为8 mg/ml的白芷提取物处理细胞24 h)、白芷-H组(用终浓度为16 mg/ml的白芷提取物处理细胞24 h)。采用MTT检测白芷提取物对A2780细胞活力的影响，选用抑制抑制作用约为50%的白芷浓度进行后续实验。后续研究中为探讨SBF2-AS1对A2780细胞增殖及凋亡的影响，实验分组：si-NC组(si-NC转染至细胞24 h)、si-SBF2-AS1组(si-SBF2-AS1si-NC转染至细胞24 h)。为验证白芷提取物是否通过调控SBF2-AS1而发挥作用，实验分组：白芷-M+pcDNA3.1组(pcDNA3.1转染至细胞24 h，用含有终浓度为8 mg/ml的白芷提取物处理细胞24 h)、白芷-M+pcDNA3.1-SBF2-AS1组(pcDNA3.1-SBF2-AS1转染至细胞24 h，用含有终浓度为8 mg/ml的白芷提取物处理细胞24 h)。

1.2.2MTT检测细胞增殖 取对数生长期A2780细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养液制备单细胞悬液，调整细胞密度至3×104个/ml，按照每孔100 μl接种至96孔板，按照1.2.1分组处理，分别于作用24 h、48 h、72 h时，每孔加入20 μl MTT(质量浓度5 mg/ml)，室温孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，充分混匀，应用酶标仪检测各孔吸光度值(OD 490 nm)。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组A2780细胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤，加入500 μl结合缓冲液，加入5 μl Annexin V-FITC，充分混匀，加入5 μl PI，室温避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中SBF2-AS1、miR-329-3p表达水平 采用Trizol法提取细胞总RNA，参照Primescript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将总RNA合成cDNA，SBF2-AS1正向引物5′-CACGACCCAGAAGGAGTCTAC-3′，反向引物：5′-CCCGGTACCTTCCTGTCATA-3′；miR-329-3p正向引物5′-GGGAACACACCTGGTTAAC-3′，反向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。qRT-PCR反应以cDNA为模板，参照SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒配置反应体系，反应条件：95℃ 2 min(循环1次)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s(循环40次)，SBF2-AS1以GAPDH为内参，miR-329-3p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算SBF2-AS1、miR-329-3p相对表达量。

1.2.5双荧光素酶报告基因检测 starBase预测SBF2-AS1与miR-329-3p存在结合位点，将结合位点载入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体WT-SBF2-AS1，利用基因突变技术将结合位点进行突变，将突变位点载入荧光素酶报告基因载体构建突变型载体MUT-SBF2-AS1，取对数生长期A2780细胞，随机分成4组：WT-SBF2-AS1+miR-NC共转染组、WT-SBF2-AS1+miR-329-3p mimics共转染组、MUT-SBF2-AS1+miR-NC共转染组、MUT-SBF2-AS1+miR-329-3p mimics共转染组，继续培养24 h，收集各组细胞检测荧光素酶活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。qRT-PCR法检测SBF2-AS1对miR-329-3p的调控作用，取对数生长期A2780细胞随机分成4组：pcDNA3.1组、pcDNA3.1-SBF2-AS1组、si-NC组、si-SBF2-AS1组，检测各组细胞中miR-329-3p的表达水平。

1.2.6Western印迹检测CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax蛋白表达 收集各组A2780细胞，加入适量蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，按照BCA试剂盒操作测定蛋白浓度，每孔30 μg蛋白上样量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳反应条件：80 V 30 min，120 V 90 min，分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温条件下采用5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗稀释液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗涤，孵育二抗稀释液(1∶2 000)，TBST洗涤，暗室内曝光，显影，应用凝胶成像分析系统及ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析、LSD-t检验、Kruska-WallisH检验。

2 结 果

2.1白芷对A2780细胞增殖的影响 与对照组相比，白芷-L组、白芷-M组、白芷-H组A2780细胞活力显著降低(P<0.05)，白芷-H组A2780细胞活力显著低于白芷-L组、白芷-M组(P<0.05)，白芷-M组A2780细胞活力显著低于白芷-L组(P<0.05)，选用抑制作用约为50%的白芷浓度白芷-M(40 μg/ml)做后续实验，见表1。Western印迹检测结果显示，与对照组相比，白芷-L组、白芷-M组、白芷-H组A2780细胞中CyclinD1蛋白表达量显著降低(P<0.05)，P21蛋白表达量显著升高(P<0.05)，且白芷不同剂量组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

图1 白芷对细胞A2780增殖蛋白表达的影响

表1 白芷对细胞A2780增殖的影响

2.2白芷对A2780细胞凋亡的影响 与对照组比较，白芷-M组A2780细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)，见图2、表2。

A：白芷对细胞A2780凋亡的影响；B：白芷对细胞A2780凋亡蛋白表达的影响图2 白芷对细胞A2780凋亡及凋亡蛋白表达的影响

表2 白芷对细胞A2780凋亡的影响

2.3白芷对A2780细胞中SBF2-AS1、miR-329-3p表达的影响 与对照组相比，白芷-M组A2780细胞中SBF2-AS1的表达水平显著降低(P<0.05)，miR-329-3p的表达水平显著升高(P<0.05)，见表3。

表3 白芷对细胞A2780中SBF2-AS1、miR-329-3p表达的影响

2.4抑制SBF2-AS1对A2780细胞增殖、凋亡的影响 与si-NC组相比，si-SBF2-AS1组A2780细胞活力显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)，P21、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05)，见表4、图3。

表4 抑制SBF2-AS1对细胞A2780增殖、凋亡的影响

图3 抑制SBF2-AS1对细胞A2780增殖、凋亡蛋白表达的影响

2.5过表达SBF2-AS1能逆转白芷对A2780细胞增殖、凋亡的作用 与白芷-M+pcDNA3.1组比较，白芷-M+pcDNA3.1-SBF2-AS1组细胞活力显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，SBF2-AS1的表达水平显著升高(P<0.05)，miR-329-3p的表达水平显著降低(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量显著增加(P<0.05)，P21、Bax蛋白表达量显著降低(P<0.05)，见图4、表5。

1～4:对照组、白芷-M组、白芷-M+pcDNA3.1组、白芷-M+pcDNA3.1-SBF2-AS1组图4 过表达SBF2-AS1能逆转白芷对细胞A2780增殖、凋亡蛋白表达的影响

表5 过表达SBF2-AS1能逆转白芷对细胞A2780增殖、凋亡的影响

2.6SBF2-AS1靶向、调控miR-329-3p starBase预测显示SBF2-AS1的3′UTR中含有与miR-329-3p互补的核苷酸序列，见图5。双荧光素酶报告实验结果显示，与WT-SBF2-AS1+miR-NC共转染组相比，WT-SBF2-AS1+miR-329-3p共转染组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；相较于MUT-SBF2-AS1+miR-NC共转染组，MUT-SBF2-AS1+miR-329-3p共转染组荧光素酶活性无明显变化，见表6。qRT-PCR检测结果显示，与pcDNA3.1组(0.31±0.03)相比，pcDNA3.1-SBF2-AS1组A2780细胞中miR-329-3p的表达水平显著降低(0.09±0.01，P<0.05)；与si-NC组(0.32±0.03)相比，si-SBF2-AS1组A2780细胞中miR-329-3p的表达水平显著升高(0.69±0.07，P<0.05)。

图5 SBF2-AS1靶向miR-329-3p

表6 双荧光素酶报告实验

3 讨 论

长期化疗导致卵巢癌患者出现化疗耐药性，还可增强卵巢癌细胞恶性程度〔9〕。因而寻找副作用小且低廉有效的药物对提高卵巢癌治疗效果具有重要意义。研究表明中药黄连素可有效抑制卵巢癌细胞增殖并可提高细胞凋亡率〔10〕。

白芷提取物可通过诱导结肠癌细胞凋亡、抑制细胞增殖及增强细胞抗氧化能力而发挥抗癌活性〔11〕。白芷提取物还可通过激活线粒体凋亡途径诱导HepG2细胞凋亡从而发挥抗癌作用〔12〕。研究表明白芷中提取的欧前胡素还可通过调控mTOR/p70S6K/4E-BP1和MAPK途径抑制结肠癌细胞的增殖及血管生成〔13〕。但白芷提取物对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响尚未可知。本研究结果提示白芷提取物可有效抑制卵巢癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，可显著促进P21、Bax的表达，而抑制CyclinD1、Bcl-2的表达。研究表明CyclinD1在肿瘤细胞中呈高表达，并可通过调控细胞周期影响细胞增殖，P21可负向调控细胞周期，抑制细胞增殖〔14〕。细胞增殖与凋亡失衡是促进肿瘤发生发展的重要原因，研究表明Bcl-2可抑制细胞凋亡，而Bax可促进细胞凋亡〔15〕。提示白芷提取物可通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白表达而抑制卵巢癌细胞增殖，促进细胞凋亡。

SBF2-AS1通过竞争性吸附miR-619-5p而抑制其活性进而上调HDAC3的表达最终促进结直肠癌细胞增殖及侵袭〔16〕。研究表明SBF2-AS1还可通过调节miR-361-5p/FOXM1轴进而促进宫颈癌的进展〔17〕。SBF2-AS1还可通过调孔miR-140-5p/TGFBR1途径促进肝细胞癌的进展〔18〕。但SBF2-AS1在卵巢癌中的作用机制尚未见报道。本研究结果提示沉默SBF2-AS1的表达可抑制卵巢癌细胞增殖及诱导细胞凋亡。本研究双荧光素酶报告实验与qRT-PCR实验结果显示SBF2-AS1可竞争性结合miR-329-3p，并可负向调控miR-329-3p的表达与活性。研究表明LncRNA TP73-AS1通过调控miR-329-3p / ARF1轴促进宫颈癌发生发展〔19〕。miR-329-3p可靶向MAPK1而抑制宫颈癌细胞增殖，迁移及侵袭〔20〕。本研究提示白芷提取物可能通过抑制SBF2-AS1的表达及促进miR-329-3p的表达从而抑制卵巢癌细胞增殖及促进细胞凋亡。为验证上述推测，本研究实验结果显示，SBF2-AS1过表达能逆转白芷提取物对卵巢癌细胞增殖、凋亡的作用。本研究首次证实白芷提取物可通过调控SBF2-AS1/miR-329-3p轴而抑制卵巢癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。

综上，白芷提取物可有效抑制卵巢癌细胞增殖，具有明显的剂量依赖性，还可提高卵巢癌细胞凋亡率，诱导细胞凋亡，其主要通过调控SBF2-AS1/miR-329-3p轴而发挥抗肿瘤作用，可为卵巢癌治疗提供新方向。