叶艳芳 韩芬 刘健峰 徐文涛

(郑州铁路职业技术学院药学院，河南 郑州 450000)

胃癌属于消化系统恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率较高，随着年龄的增长胃癌患者发病率总体呈上升趋势，目前临床主要采用手术切除并辅以放化疗的手段进行治疗，但进展期或晚期胃癌患者不可进行手术，而采用放疗或化疗等治疗手段对患者身体造成一定毒副作用甚至降低患者生存质量〔1〕。因而积极探寻胃癌发病机制及其治疗方法对降低胃癌死亡率及改善患者预后均具有重要意义。研究表明微小RNA-539(miR-539)在骨肉瘤组织中表达降低，其低表达与患者TNM分级及肿瘤转移密切相关〔2〕。miR-539通过调控SPAG5的表达抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔3〕。研究报道指出微小RNA-539-5p(miR-539-5p)在鼻咽癌组织和细胞中表达下调，抑制鼻咽癌细胞的生长〔4〕。但关于miR-539-5p在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响尚未可知。Xklp2 靶蛋白(TPX2)在胃癌、乳腺癌中高表达，沉默TPX2表达可抑制胃癌细胞和乳腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡〔5，6〕。下调TPX2表达能抑制卵巢癌细胞的增殖，诱导卵巢癌细胞的凋亡，降低细胞的克隆形成能力〔7〕。在宫颈癌细胞过表达TPX2基因后，能抑制细胞凋亡，增强其侵袭能力〔8〕。通过靶基因预测网站发现TPX2可能是miR-539-5p的靶基因，然而miR-539-5p是否通过靶向TPX2调控胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭目前还尚未可知。因此，本研究探讨miR-539-5p在胃癌细胞中的表达，通过上调胃癌细胞中miR-539-5p的表达，观察胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力变化，分析其与TPX2是否存在靶向调控关系。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人正常胃黏膜上皮细胞(GES)-1与胃癌细胞系MGC-803、MKN-45、AGS均购自中国医学科学院细胞中心。杜氏改良培养基(DMEM)培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；青霉素(100 U/ml)与链霉素(0.1 mg/ml)购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂、miRNA反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒与LipofectamineTM2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；甲基噻唑基四唑(MTT) 与二甲基亚砜(DMSO)均购自瑞士Roche公司；miR-539-5p mimics及对照、TPX2小干扰RNA(si-TPX2)及对照均购自广州锐博生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；增强型化学发光试剂(ECL)购自美国Milipore公司；兔抗人TPX2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；Transwell小室购自美国康宁公司；细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14一抗均购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；基质胶购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染及分组 正常胃黏膜上皮细胞株GES-1与胃癌细胞MGC-803、MKN-45、AGS均培养于含有10%FBS及双抗的DMEM培养基，放置于37℃、5%CO2培养箱内孵育，用于提取细胞RNA并检测细胞系中miR-539-5p和TPX2的表达情况。待细胞生长汇合度达80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，经1 000 r/min转速4℃离心10 min，收集胃癌MGC-803细胞，加入DMEM培养基稀释为细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/ml，吸取2 ml MGC-803细胞接种于6孔板，放入37℃、5%CO2培养箱内孵育，待细胞汇合度达到80%左右时进行转染。实验分组为：miR-539-5p组、miR-NC组、si-TPX2组、si-NC组、miR-539-5p+pcDNA-TPX2组、miR-539-5p+pcDNA组。采用无菌无酶EP管配置LipofectamineTM2000与miR-539-5p mimics、si-TPX2、miR-539-5p抑制剂(anti-miR-539-5p)、TPX2过表达载体(pcDNA-TPX2)转染试剂，依次配置完成后，充分混匀，置于室温放置20 min，将其加入不含血清及双抗的DMEM培养基，加入待转染的6孔板内，置于37℃、5%CO2培养箱内继续培养6 h，将培养基更换为含有10%FBS及双抗的DMEM完全培养基，可进行Transwell细胞迁移、侵袭及细胞增殖实验研究，还可继续培养48 h后，收集细胞提取RNA及蛋白检测相关基因或蛋白表达。

1.2.2qRT-PCR检测胃癌细胞中miR-539-5p、TPX2 mRNA表达水平 收集各组对数生长期细胞接种于6孔板，每孔分别加入100 μl Trizol试剂，随后依次加入氯仿，室温振荡15 s后放置5 min，4℃条件下，12 000 r/min转速离心15 min，吸取上层液体置于另一无菌无酶的EP管内，加入异丙醇充分混匀后，室温静置10 min，4℃条件下，12 000 r/min转速离心15 min，弃上清，加入1 ml 75%乙醇洗涤RNA，4℃条件下，7 500 r/min转速离心5 min，弃上清，置于超净工作台内晾干，加入20～30 μl DEPC水溶解RNA，吸取2 μl RNA检测RNA浓度及纯度，检测时RNA A260/A280处于1.8～2.0提示RNA浓度适宜并可进行后续实验研究。以RNA为模板，参照反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，参照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作，反应体系共20 μl，每组均设置3次重复，反应条件为95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循环40次，采用2-ΔΔCt法计算miR-539-5p、TPX2 mRNA的相对表达量。

1.2.3Western印迹检测TPX2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14的蛋白表达 收集各组对数生长期细胞提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝电泳(SDS-PAGE)实验以此分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，分别加入蛋白一抗，TPX2蛋白稀释比为1∶1 000，CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白稀释比均为1∶500，TBST洗涤，分别加入二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，加入ECL，X胶片曝光，显影及定影后，利用凝胶分析系统扫描并保存条带图片，应用Quantity One软件分析分析目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH的蛋白灰度值的比值，以此表示目的蛋白相对表达量，每组实验均设置3个复孔。

1.2.4MTT检测胃癌细胞增殖 分别收集转染后24 h、48 h、72 h时胃癌MGC-803细胞，制备单细胞悬液(密度1×105个/ml)，按照每孔200 μl的密度将细胞接种于96孔板内，每组均设置6个复孔，实验结束前4 h每孔分别加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，放入恒温培养箱常规培养4 h，弃上清，每孔分别加入150 μl DMSO溶液，振荡混匀后置于酶标仪检测波长为490 nm处各孔光密度值，每个样本均设置3次重复。

1.2.5Transwell实验检测胃癌细胞迁移及侵袭 收集转染48 h后的胃癌MGC-803细胞，加入不含血清及双抗的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，同时用不含血清及双抗的DMEM培养基以8∶1的比例稀释基质胶，将稀释后的基质胶包被于Transwell小室底部的上室面(侵袭实验铺胶，细胞迁移实验未铺胶)。分别取各组200 μl细胞悬液加入Transwell小室的上室，将500 μl含有10%FBS及双抗的DMEM培养基加入24板Transwell小室的下室，放入恒温培养箱继续培养24 h，取出Transwell小室，PBS洗涤，用棉签擦去基质胶及微孔膜上层细胞，采用多聚甲醛固定20 min，加入结晶紫染色15 min，置于倒置显微镜下计算转移至微孔膜下层的细胞数，每个样本均随机选取6个视野求取细胞计数的平均数。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验 TPX2的3′(非翻译区UTR)区域序列预测与miR-539-5p有关，将预测序列插入pGL3的催化剂载体pGL3-TPX2-WT构建野生型(WT)-TPX2载体，将预测靶点的变异序列整合后插入pGL3-TPX2-MUT构建突变型(MUT)-TPX2载体，同时将胃癌MGC-803细胞接种于24孔板，将WT-TPX2载体、MUT-TPX2载体分别与miR-539-5p mimics及其对照共转染入胃癌MGC-803细胞，参照荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测MGC-803细胞相对荧光素酶活性。

1.3统计学处理 应用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1miR-539-5p和TPX2在胃癌细胞和正常胃黏膜上皮细胞中的表达 与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，胃癌MGC-803、MKN-45、AGS细胞中miR-539-5p的表达水平均显著降低(P<0.05)，而TPX2 mRNA及蛋白的表达的水平均显著升高(P<0.05)，相较于其他胃癌细胞，miR-539-5p在胃癌MGC-803细胞中的表达水平相对较低，因此后续研究中选取MGC-803细胞为研究材料。见图1、表1。

图1 TPX2蛋白表达

表1 miR-539-5p和TPX2在胃癌细胞和正常胃黏膜上皮细胞中的表达

2.2miR-539-5p过表达对胃癌MGC-803细胞增殖的影响 与miR-NC组相比，miR-539-5p组胃癌MGC-803细胞中miR-539-5p的表达水平明显升高(P<0.05)。miR-539-5p组胃癌MGC-803细胞48 h、72 h增殖活性较miR-NC组显著降低(P<0.05)，miR-539-5p组胃癌MGC-803细胞中CyclinD1的表达水平较miR-NC组显著降低(P<0.05)，而p21、p27的表达水平均显著升高(P<0.05)，见图2、表2。

图2 Western印迹检测增殖相关蛋白表达

表2 miR-539-5p过表达对胃癌MGC-803细胞增殖的影响

2.3miR-539-5p过表达对胃癌MGC-803细胞迁移、侵袭的影响 与miR-NC组相比，miR-539-5p组胃癌MGC-803细胞迁移及侵袭细胞数均显著减少(P<0.05)，而细胞迁移及侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14的表达水平均显著降低(P<0.05)，见图3、表3。

表3 miR-539-5p过表达对胃癌MGC-803细胞迁移、侵袭的影响

2.4抑制TPX2表达对胃癌MGC-803细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与si-NC组相比，si-TPX2组胃癌MGC-803细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显受到抑制(P<0.05)，与si-NC组比较，si-TPX2组胃癌MGC-803细胞中p21的表达水平显著升高(P<0.05)，而CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表达水平均显著降低(P<0.05)，见表4、图4。

表4 抑制TPX2表达对胃癌MGC-803细胞增殖、迁移、侵袭的影响

图4 Western印迹检测TPX2和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

2.5miR-539-5p靶向调控TPX2的表达 miR-539-5p可明显抑制WT-TPX2的3′UTR的双荧光素酶活性(P<0.05)，见图5、表5。进一步研究显示miR-539-5p过表达可明显降低胃癌MGC-803细胞TPX2的表达(miR-NC组：0.61±0.06、miR-539-5p组0.24±0.02，P<0.05)，而抑制miR-539-5p表达可明显升高胃癌MGC-803细胞TPX2的表达(anti-miR-NC组：0.59±0.05、anti-miR-539-5p组：0.93±0.08，P<0.05)，见图6。

图5 TPX2的3′UTR中含有与miR-539-5p互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

图6 Western印迹检测TPX2蛋白表达

2.6TPX2过表达逆转了miR-539-5p过表达对MGC-803细胞增殖、迁移、侵袭的作用 与miR-539-5p+pcDNA组相比，miR-539-5p+pcDNA-TPX2组胃癌MGC-803细胞增殖活性明显增强(P<0.05)，迁移及侵袭细胞数均明显增加(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表达水平均明显升高(P<0.05)，而p21的表达水平显著降低(P<0.05)，见图7、表6。

1～4:miR-NC组、miR-539-5p组、miR-539-5p+pcDNA组、miR-539-5p+pcDNA-TPX2组图7 Western印迹检测TPX2和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表6 TPX2的过表达逆转了miR-539-5p过表达对MGC-803细胞增殖、迁移、侵袭的作用

3 讨 论

胃癌患者死亡率升高的主要原因为肿瘤转移，胃癌细胞迁移及侵袭引发胃癌转移的作用机制尚未完全阐明，目前临床尚缺乏治疗转移性胃癌的有效治疗手段〔9〕。miRNA可通过与靶基因结合而降解mRNA并抑制其翻译从而调控基因表达，研究表明miRNA与多种恶性肿瘤发生及发展有关，张金梅等〔10，11〕研究表明miR-638可通过靶向调控性别决定区Y框蛋白(SOX)2表达而抑制上皮-间质转化(EMT)进程进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭。但仍有部分miRNA与胃癌细胞迁移及侵袭的内在作用机制尚未完全阐明，因此本研究拟积极探寻与胃癌细胞迁移及侵袭相关的miRNA。

miR-539可通过靶向抑制脚手架蛋白CARMA1表达进而抑制甲状腺癌细胞迁移〔12〕。佘青等〔13〕研究表明miR-539在乳腺癌细胞中呈低表达，miR-539过表达可显著降低乳腺癌细胞增殖能力并促进细胞凋亡。Yu等〔14〕研究表明miR-539在胰腺癌中的表达水平降低，上调miR-539表达可抑制胰腺癌细胞增殖及迁移。研究发现miR-539在多种肿瘤发生发展过程中均发挥抑癌基因作用，其可通过下调JAG1及Notch1/3表达进而抑制Wilms肿瘤的进展〔15〕。miR-539还可通过靶向高迁移率组蛋白A2表达进而抑制肾细胞癌细胞增殖并诱导细胞凋亡〔16〕。以上研究结果表明miR-539在恶性肿瘤发生及发展过程中均呈低表达，上调miR-539表达可抑制肿瘤进展。本研究结果与上述文献报道相似，说明miR-539-5p在胃癌发生过程中可能发挥抑癌基因作用。本研究进一步研究表明肿瘤细胞异常增殖与细胞周期调控紊乱有关，其中G1期转变为S期是细胞周期转变的关键所在，CyclinD1可通过激活CDK4/CDK6而促进G1期转化为S期进而调控细胞周期转变过程，而p21与p27是CyclinD1与CDK4/CDK6的抑制剂，其可通过结合细胞周期蛋白及CDK而诱导细胞周期停滞于G1期进而抑制肿瘤生长〔17，18〕。进一步研究发现转染 miR-539-5p mimics后胃癌细胞迁移及侵袭细胞数均明显减少，并可明显抑制MMP-2、MMP-9、MMP-14表达，MMPs可降解细胞外基质内的蛋白组分进而促进肿瘤细胞转移〔19，20〕。说明转染miR-539-5p mimics能够明显抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭。提示miR-539-5p在胃癌发生及发展过程中发挥抑癌基因作用。

TPX2在多种恶性肿瘤中均呈高表达，其表达量异常增高可促进细胞发生癌变，在肿瘤发生及发展过程中均发挥癌基因作用进而促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡，同时可增强细胞迁移及侵袭能力〔21〕。TPX2作为一种受细胞调控的微管相关蛋白，在舌鳞状细胞癌、肝癌及食管癌等多种恶性肿瘤中的表达量均明显增加，其可通过调控细胞周期进而影响肿瘤转移及复发过程〔22〕。Chen等〔23〕研究表明干扰TPX2表达后可通过抑制PI3K/AKT信号通路激活进而抑制乳腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡。段长胜等研究表明TPX2在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，其高表达量与患者临床分期及淋巴结转移呈正相关，但关于TPX2在胃癌转移过程中的具体作用机制仍需进一步探讨〔24〕。与上述文献报道相似，本研究结果说明沉默TPX2可通过影响细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达进而影响胃癌细胞增殖、迁移及侵袭过程。提示沉默TPX2表达可抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。通过靶基因预测网站预测TPX2可能为miR-539-5p的靶基因，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-539-5p与TPX2的靶向结合关系，结果提示miR-539-5p可负向调控靶基因TPX2表达。然而miR-539-5p与TPX2在胃癌细胞中的表达机制尚未完全阐明，本研究结果表明miR-539-5p过表达可通过抑制TPX2表达进而抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭。提示miR-539-5p可能作为胃癌的潜在治疗靶点。

综上，胃癌发生发展进程中TPX2是miR-539-5p的一个功能性靶基因，miR-539-5p过表达可通过降低TPX2表达进而抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭，为胃癌临床分子治疗奠定理论基础。但关于miR-539-5p与胃癌发生发展相关信号通路的相关性仍需深入研究。