陈天佑 熊飞 张倬 李雪曼

(武汉市第三医院胸外科,湖北 武汉 430060)

肺癌是全球癌症相关死亡的最常见原因，每年约有1 800万人被诊断出患有肺癌，大概1 600万人因该疾病而死亡〔1〕。目前，尽管肺癌的临床治疗取得了进展，患者的预后仍然不利，5年生存率约15%〔2〕，总体存活时间没有明显改善〔3〕。因此，迫切需要确定肺癌发展的潜在机制，并开发新的诊断生物标志物和治疗肺癌的有效策略。长链非编码RNA(LncRNA)是长度超过200个核苷酸的非蛋白质编码转录物，尽管大多数LncRNA的作用机制仍然未知，但越来越多的证据表明，LncRNA是多种生物过程中的重要调节因子，包括细胞生长和细胞凋亡等过程〔4，5〕。反义胰岛素样生长因子2(IGF2-AS)是LncRNA中的一种，研究发现IGF2-AS在胃腺癌组织中表达上调，通过调控微小RNA-503(miR-503)影响胃癌的预后和转移〔6〕。然而，关于IGF2-AS在肺癌中的表达及其功能，这方面的资料尚不多见。因此，本研究以肺癌细胞为对象，观察IGF2-AS在肺癌细胞中表达情况，利用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术等方法检测IGF2-AS对肺癌细胞增殖和凋亡的影响，并结合生物信息学预测其下游靶基因miR-370-3p揭示可能的作用机制，为IGF2-AS在肺癌诊断和治疗中的应用提供新思路。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器 人肺癌细胞系H1299、A549、SPC-A-1、NCI-H446购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，正常肺表皮细胞HPL-1购自协和医科大学实验中心，DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，TRIzol、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，si-IGF2-AS、pcDNA-IGF2-AS、miR-370-3p、anti-miR-370-3、荧光素酶报告载体购自上海GenePharma公司，MTT、RIPA裂解液购自美国Sigma公司，膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore公司，β肌动蛋白(β-actin)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化(p)-PI3K、蛋白激酶B(AKT)和p-AKT抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自Santa Cruz公司。凝胶成像系统购自Bio-Rad公司，BD FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2细胞培养与转染 HPL-1、H1299、A549、SPC-A-1、NCI-H446细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，于5% CO2、37℃培养箱中培养，观察到细胞融合至70%～80%时，使用胰酶消化、传代。

1.3实时荧光定量PCR(qPCR)检测IGF2-AS和miR-370-3p表达 根据制造商的说明，使用TRIzol试剂提取H1299细胞总RNA，用逆转录试剂盒进行逆转录，以得到的cDNA为模板，利用ABI 7500 qPCR仪检测IGF2-AS和miR-370-3p表达。IGF2-AS上游引物序列：5′-TGGGAAGTAGGACTAAGGAC-3′，下游：5′-TTGGCTTTGGGCAGATTGAG-3′；miR-370-3p上游引物序列：5′-TGTAACCAGAGAGCGGGATGT-3′，下游：5′-TTTTGGCATAACTAAGGCCGA A-3′。以U6为内参，通过2-ΔΔCt法计算IGF2-AS和miR-370-3p表达量。

1.4细胞转染 细胞转染前24 h，选取处于对数生长期的H1299细胞，以1×105个/ml的密度接种于6孔板，细胞融合度为70%左右时，通过Lipofectamine 2000试剂进行转染，将si-IGF2-AS、pcDNA-IGF2-AS、miR-370-3p、anti-miR-370-3及各自阴性对照转染入H1299细胞。转染48 h后，收集细胞用于后续研究。

1.5MTT法检测细胞增殖 收集正常培养(NC组)和转染后的H1299细胞，胰酶消化，将细胞密度调整为5×104个/ml，并接种于96孔板。培养24 h、48 h和72 h后，将100 μl MTT溶液(5 mg/ml)加入各孔细胞中，37℃反应4 h，加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)，置37℃摇床震荡培养10 min，酶标仪读取各孔细胞的吸光度值OD490 nm值，其中，检测波长为490 nm。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 细胞凋亡的测定参照Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒步骤进行，收集H1299细胞5×105个，用500 μl缓冲液悬浮细胞，吸取Annexin V-FITC 5 μl加入细胞中，混匀后加入PI 5 μl，混匀，遮光保持10 min，通过流式细胞仪评估细胞凋亡。

1.7Western印迹法检测目的蛋白表达 用RIPA裂解液从H1299细胞中提取蛋白。吸取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移到PVDF膜，将膜在5%脱脂奶粉中封闭1 h，4℃条件下与目的蛋白一抗(稀释度为1∶1 000)孵育，之后在室温下与二抗(稀释度为1∶2 500)孵育2 h。以β-actin为内参蛋白，分析CyclinD1、CDK4、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达。

1.8双荧光素酶报告基因 通过startbase(http：//starbase.sysu.edu.cn/)预测到IGF2-AS与miR-370-3p存在靶向序列。构建包含miR-370-3p结合序列的野生型IGF2-AS(WT-IGF2-AS)、突变型IGF2-AS(MUT-IGF2-AS)的3，非编码区域(UTR)荧光素酶报告基因载体，并与miR-370-3p或miR-con共转染到H1299细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定细胞双荧光素酶活性。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1IGF2-AS和miR-370-3p在肺癌细胞系和正常肺表皮细胞HPL-1中的表达 与HPL-1细胞比较，肺癌细胞系H1299、A549、SPC-A-1、NCI-H446中IGF2-AS表达量明显增加(P<0.05)，miR-370-3p表达量显著减少(P<0.05)。见表1。选取IGF2-AS表达量差异最显著的H1299细胞开展后续研究。

表1 IGF2-AS和miR-370-3p在肺癌细胞系和正常肺表皮细胞HPL-1中的表达

2.2沉默IGF2-AS表达对肺癌H1299细胞增殖和增殖相关蛋白表达的影响 转染si-IGF2-AS后细胞中IGF2-AS表达量显著低于si-con组(P<0.05)，说明转染有效。同si-con组相比，沉默IGF2-AS表达对24 h的细胞活性无明显影响，而显著降低48 h、72 h的细胞活性(P<0.05)。相较于si-con组，沉默IGF2-AS表达明显减少CyclinD1和CDK4蛋白表达量(P<0.05)。见表2，图1。

图1 Western印迹检测CyclinD1和CDK4蛋白表达

2.3沉默IGF2-AS表达对肺癌H1299细胞凋亡和凋亡相关蛋白表达的影响 与si-con组比较，沉默IGF2-AS表达明显提高H1299细胞凋亡率(P<0.05)，显著降低Bcl-2蛋白水平，显著增加Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达量(P<0.05)。见表2、图2。

表2 沉默IGF2-AS表达对H1299细胞增殖、凋亡及相关蛋白表的影响

2.4IGF2-AS靶向调控miR-370-3p的表达 生物信息学预测出IGF2-AS与miR-370-3p序列中部分核苷酸可形成互补配对(图3)，猜想miR-370-3p可能是IGF2-AS的靶基因之一。双荧光素酶报告实验结果显示(表3)，WT-IGF2-AS的荧光素酶相对活性被miR-370-3p显著抑制(P<0.05)，MUT-IGF2-AS的荧光素酶活性不受miR-370-3p影响。qPCR数据表明，转染si-IGF2-AS较si-con组明显提升miR-370-3p表达量(5.89±0.59 vs 1.00±0.12；P<0.05)，转染pcDNA-IGF2-AS比pcDNA组显著减少miR-370-3p表达量(0.32±0.05 vs 0.85±0.09；P<0.05)。

A 流式细胞术检测细胞凋亡；B Western印迹检测Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达图2 沉默IGF2-AS表达对肺癌H1299细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响

图3 IGF2-AS中含有与miR-370-3p互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.5抑制miR-370-3p表达逆转了沉默IGF2-AS表达对肺癌H1299细胞增殖和细胞凋亡的作用 与si-con组比较，沉默IGF2-AS表达明显影响H1299细胞中miR-370-3p、48h、72h时的细胞活性、Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达及细胞凋亡率(P<0.05)。与si-IGF2-AS+anti-miR-con组相比，共转染si-IGF2-AS和anti-miR-370-3p明显减少H1299细胞中miR-370-3p表达量，提高48 h、72 h时的细胞活性，降低细胞凋亡率，增加CyclinD1、CDK4、Bcl-2蛋白表达量并抑制Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达，上述差异均达到显著水平(P<0.05)。见表4、图4。

2.6抑制miR-370-3p表达逆转了沉默IGF2-AS表达对肺癌H1299细胞中AKT信号通路的影响 同si-con组相比，沉默IGF2-AS表达对PI3K、AKT蛋白水平无明显影响，但显著抑制p-PI3K、p-AKT蛋白表达量(P<0.05)。同si-IGF2-AS+anti-miR-con组相比，si-IGF2-AS和anti-miR-370-3p共转染不影响PI3K、AKT蛋白表达，明显提高p-PI3K、p-AKT蛋白水平(P<0.05)。见表4、图5。

表4 抑制miR-370-3p表达逆转了沉默IGF2-AS表达对肺癌H1299细胞增殖、凋亡及AKT信号通路的影响

1～4：si-con组、si-IGF2-AS组、si-IGF2-AS+anti-miR-con组、si-IGF2-AS+anti-miR-370-3p组；图5同图4 Western印迹检测肺癌H1299细胞中CyclinD1、CDK4、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达

图5 Western印迹检测肺癌H1299细胞中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达

3 讨 论

肺癌分为两个主要组织学类别：小细胞肺癌(占所有肺癌的15%)和非小细胞肺癌(占所有肺癌的85%)〔7〕。虽然早期发现肺癌的技术和策略有所改善，但大多数肺癌仍在晚期诊断，并且许多肺癌患者缺乏针对性的治疗方案。因此，新型诊断生物标志物和治疗策略的鉴定是肺癌管理的先决条件。

LncRNA涉及广泛的生物学功能，如细胞生长，细胞周期进程，细胞增殖和细胞凋亡等〔8〕。资料显示，LncRNA在癌症中起主要作用，肿瘤样本的全基因组关联研究已经鉴定出大量LncRNA与各种类型的癌症相关〔9〕。近年来，LncRNAs被认为是恶性肿瘤潜在的诊断和治疗工具，包括肺癌在内。LncRNA可能表现出肿瘤抑制或促进(致癌)功能，影响肿瘤的发生和转移，如SET结合因子2反义RNA1(SBF2-AS1)被发现作为非小细胞肺癌中的致癌LncRNA〔10〕，含Ⅰ型血小板反应蛋白模体的解聚素金属蛋白酶反义RNA2(ADAMTS9-AS2)作为抑癌因子阻滞肺癌进展〔11〕。研究表明，IGF2-AS在肝癌组织中异常表达，且明显影响肿瘤数目、微血管侵犯〔12〕。IGF2-AS参与丙型肝炎病毒的复制〔13〕，可能充当致癌因子的功能，调控胃腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭活动〔6〕，也被鉴定为威尔姆肿瘤中的癌症调节剂，抑制IGF2-AS促进神经元生长并保护局部麻醉诱导的脊髓背根神经节神经毒性〔14〕。在肝癌组织和细胞中IGF2-AS表达上调〔15〕，这与本研究中的结果一致。敲低IGF2-AS显著降低肝癌细胞增殖并增加细胞凋亡〔15〕，本研究有同样发现提示IGF2AS在肺癌进展中可能发挥肿瘤启动子的作用，与在胃腺癌〔6〕中的功能相同。miRNA参与肺癌的发生发展过程〔16〕。研究发现，miR-370-3p抑制胶质母细胞瘤U87-MG细胞和胶质瘤细胞U251增殖〔17，18〕。miR-370-3p在甲状腺癌中表达下调，上调其表达会抑制甲状腺癌细胞增殖和侵袭〔19〕。miR-370-3p直接抑制Wnt7a表达，从而抑制膀胱癌细胞侵袭〔20〕。miR-370对肺癌细胞的增殖具有抑制作用，并能诱导细胞凋亡〔21〕。本实验中，肺癌细胞系H1299、A549、SPC-A-1、NCI-H446中miR-370-3p表达明显下调，与相关研究相符〔19〕。miR-370-3p是LncRNA H19序列中具有结合位点的miRNA之一，H19可直接与miR-370-3p结合，并有效地作为其竞争性内源RNA，影响卵巢癌细胞的上皮-间质转化(EMT)过程〔22〕。本项研究中，生物信息学预测出IGF2AS与miR-370-3p具有互补配对的核苷酸序列，双荧光素酶报告和qPCR实验证实IGF2-AS可以靶向调控miR-370-3p的表达。功能实验结果发现，抑制miR-370-3p表达逆转了沉默IGF2-AS表达对肺癌H1299细胞增殖和凋亡的影响。上述结果说明，靶向调控miR-370-3p表达可能是IGF2-AS在肺癌细胞增殖和凋亡中发挥作用的重要机制之一。

AKT信号通路影响肺癌过程，包括细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等〔23，24〕。沉默IGF2-AS表达对磷酸化PI3K和AKT有抑制作用。AKT的活化显著促进非小细胞肺癌的发生发展〔25〕。此外，PI3K参与癌细胞增殖和凋亡〔26〕。本研究结果表明IGF2-AS可能通过靶向miR-370-3p调控AKT信号通路，进而影响肺癌细胞增殖和凋亡。

综上所述，IGF2-AS在肺癌细胞中表达上调，其影响肺癌细胞增殖和凋亡的机制与靶向调控miR-370-3p表达并调控AKT信号通路有关，这为肺癌提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。