张晶晶 李涛 钟黎

(贵州中医药大学 1第一附属医院肾内科，贵州 贵阳 550001；2第二附属医院心内科；3第一附属医院重症医学科)

系膜增生性肾小球肾炎的特征在于肾小球系膜细胞(GMC)增殖和细胞外基质(ECM)沉积，系膜增生性肾小球肾炎是终末期肾病的主要原因，但其机制尚未完全阐明〔1,2〕。免疫复合物清除、免疫调节功能障碍可促进系膜增生性肾小球肾炎发作。系膜增生性肾小球肾炎的综合措施包括皮质类固醇、免疫抑制剂、抗血小板药和抗血脂药〔3,4〕，因此，抑制炎症、GMC增殖和ECM沉积的干预措施对延缓系膜增生性肾小球肾炎进展具有重要意义。炎性体NOD样受体蛋白(NLRP)3在调节细菌和无菌炎症中起重要作用，其在炎症过程中诱导白细胞介素(IL)-1β和IL-18的产生〔5,6〕。NLRP3与衔接分子和凋亡相关的斑点样蛋白相互作用，后者具有含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)募集结构域，可用于募集和激活caspase-1。NLRP3主要存在外周血单核细胞、巨噬细胞、常规脾脏中性粒细胞和树突状细胞中〔7〕。NLRP3的不当激活炎症小体可导致各种疾病的进展。例如，NLRP3炎性体的激活诱导肾脏炎症，导致慢性肾脏病〔8〕。黄芩苷是一种从黄芩中提取的黄酮类化合物，具有强大的抗炎和抗氧化活性，黄芩苷已被用于治疗各种炎性疾病，包括牙周炎、肝炎和溃疡性结肠炎〔9〕。本研究拟探讨黄芩苷对系膜增生性肾小球肾炎大鼠细胞凋亡及NLRP3/caspase-1通路的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 黄芩苷、异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒(美国sigma公司，批号23454、65474)；贝那普利(北京诺华制药有限公司，批号20186365)；抗Thy1.1单克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司，批号471585)；RNA plus酶、DNA酶Ⅰ、Omniscript RT试剂盒、实时荧光聚合酶链反应(PCR)试剂(宝日医生物技术(北京)有限公司，批号180513、180427、180528、180620)；含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(美国Sigma-Aldrich公司，批号DS4789)；二喹啉甲酸(BCA)-200蛋白质测定试剂盒(美国Pierce公司，批号10265)；兔抗鼠NLRP3、caspase-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶缀合的二抗(美国Abcam公司，批号ab61037、ab20916、ab27155、ab90174)；AU-480全自动生化仪(美国贝克曼库尔特公司)；FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)；ABI 7500定量PCR仪(美国ABI公司)；ADVIA Centaur CP全自动化学发光免疫分析仪(德国西门子公司)；CKX53显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2实验动物及分组 清洁级SD大鼠100只，由汇智泰康生物技术(北京)有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2018-0012，动物质量合格证号：00180617。大鼠随机分成5组：对照组、模型组、贝那普利组(50 mg/kg，预试验求出贝那普利的LC50为100 mg/kg，以1/2 LC50为作用剂量)、黄芩苷低、高剂量组(50、100 mg/kg)〔10〕。

1.3各实验组的制备 模型组、贝那普利组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组通过静脉内注射2.5 mg/kg抗Thy1.1单克隆抗体诱导实验性抗Thy1.1系膜增生性急性肾小球肾炎大鼠〔11〕。建模成功后各药物组给予相应药物灌胃，每天给药1次，连续4 w，对照组、模型组给予生理盐水，给药体积均为10 ml/kg。

1.4肾/体比值、24 h尿蛋白、血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平测定 试验结束后，获取大鼠体重、24 h尿液、肾脏组织，测定24 h尿蛋白、肾/体比值(肾脏质量/体重×100%)；同时获取大鼠血液，分离血清，AU-480全自动生化仪测定Scr、BUN。

1.5大鼠肾组织病理观察 肾脏组织经过脱水、脱蜡、包埋、苏木素-伊红(HE)染色，显微镜观察大鼠肾脏病理改变。

1.6大鼠肾小球细胞凋亡水平检测 肾组织切片磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗15 min，加入蛋白酶工作液，37℃孵育60 min，加入100 μl FITC缀合的膜联蛋白V反应液，避光孵育30 min，终止反应。将切片置于FACS Calibur流式细胞仪下观察，细胞核中的棕黄色颗粒显示为凋亡细胞。

1.7大鼠肾脏NLRP3、caspase-1 mRNA水平检测 使用RNA plus酶从肾脏组织中提取总RNA，用不含RNase的DNA酶Ⅰ处理。使用Omniscript RT试剂盒将1 μg总RNA用作模板以制备第一链互补DNA，使用关时荧光PCR主混合试剂在ABI 7500定量PCR仪中进行qRT-PCR，共40个循环。每个PCR循环的变性、退火、延伸条件是95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s和95℃15 s。使用GAPDH作为内参基因，将靶基因表达的相对量或倍数变化标准化。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，qRT-PCR中使用的引物序列：NLRP3正义链：5′-GGTAGGCACCGTCAAGGCTGAGAGTGATAC-3′，反义链：5′-AAGTCGCCTGTTCCTGTGATGTGCCGTAG AG-3′；caspase-1正义链：5′-TTGACCAGGGACAGGATATTTGAGGAGCGGTA-3′，反义链：5′-AAGTCGCACCGTCAAGGCTGAGTGCATAAC-3′；GAPDH正义链：5′-GAATGCGGATTCGAAACACGTGCATCTGATT A-3′；反义链：5′-TGGACTGCACCGTCAAGGCTGATGGACGAAC-3′。

1.8大鼠肾脏NLRP3、caspase-1蛋白水平检测 裂解缓冲液提取肾脏组织总蛋白质，测定蛋白浓度后进行凝胶电泳分离蛋白质，转移到聚偏氟乙烯膜上，用含有5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水封闭膜2 h，将膜在4℃下用1∶500稀释的兔抗鼠NLRP3、caspase-1抗体探测过夜，然后用辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶1 000)孵育2 h，通过使用ADVIA Centaur CP全自动化学发光免疫分析仪在X射线胶片上显现蛋白质条带，使用Quantity One分析软件通过光密度测定法定量相对蛋白质表达强度。

1.9统计学分析 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验、t检验。

2 结 果

2.1各组BUN、Scr、24 h尿蛋白、肾/体比值比较 与对照组比较，模型组BUN、Scr、24 h尿蛋白、肾/体比值水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，贝那普利组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组水平均显著降低(P<0.05)；黄岑苷低剂量组上述指标水平均显著高于贝那普利组(P<0.05)；黄芩苷高剂量组上述指标水平均显著低于黄芩苷低剂量组(P<0.05)；黄芩苷高剂量组与贝那普利组上述指标水平无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组BUN、Scr、24 h尿蛋白、肾/体比值水平及凋亡率比较

2.2各组肾组织HE染色比较 对照组肾小球结构正常；模型组基底膜、肾小球系膜细胞明显增生肿胀，伴炎症细胞浸润；贝那普利组及黄芩苷高剂量组肾小球系膜细胞轻度增生，炎症细胞浸润减少；黄芩苷低剂量组仍然可见炎症细胞浸润，肾小球肿胀增生。见图1。

图1 各组肾组织病理学改变(HE，×400)

2.3各组肾小球细胞凋亡率比较 与对照组比较，模型组肾小球细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与模型组比较，贝那普利组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组肾小球细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；黄芩苷低剂量组肾小球细胞凋亡率显著高于贝那普利组(P<0.05)；黄芩苷高剂量组肾小球细胞凋亡率显著低于黄芩苷低剂量组(P<0.05)；黄芩苷高剂量组与贝那普利组肾小球细胞凋亡率无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.4各组肾脏NLRP3、caspase-1 mRNA水平比较 与对照组比较，模型组肾脏NLRP3、caspase-1 mRNA水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，贝那普利组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组上述指标水平均显著降低(P<0.05)；黄芩苷低剂量组上述指标水平均显著高于贝那普利组(P<0.05)；黄芩苷高剂量组上述指标水平均显著低于黄芩苷低剂量组(P<0.05)；黄芩苷高剂量组与贝那普利组上述指标水平无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组肾脏NLRP3、caspase-1 mRNA及NLRP3、caspase-1蛋白水平比较

2.5各组肾脏NLRP3、caspase-1蛋白水平比较 与对照组比较，模型组肾脏NLRP3、caspase-1蛋白水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，贝那普利组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组上述指标水平降低(P<0.05)；黄芩苷低剂量组上述指标水平均显著高于贝那苷利组(P<0.05)；黄芩苷高剂量组上述指标水平均显著低于黄芩苷低剂量组(P<0.05)，黄芩苷高剂量组与贝那普利组上述指标水平无统计学差异(P>0.05)。见表2、图2。

1～5:对照组，模型组，贝那普利组，黄芩苷低剂量组，黄芩苷高剂量组图2 各组肾脏NLRP3、caspase-1蛋白水平比较

3 讨 论

黄芩苷已被证明具有抗氧化、抗菌、抗炎和清除自由基的活性。黄芩苷还在体外和体内表现出抗流感病毒A(H1N1)活性，其作为细胞中干扰素(IFN)-γ的有效诱导剂，可抑制病毒在vero细胞内的复制。黄芩苷可诱导人肝癌HepG2和SMMC-7721细胞凋亡，并显著抑制裸鼠中异种移植物的生长〔12〕。在HBE16气道上皮细胞中，黄芩苷通过抑制核转录因子(NF)-κB信号通路激活进而抑制IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α表达，抑制辅助性T细胞17反应并减少二氧化硅诱导的炎症和纤维化〔13〕。贝那普利可抑制血管紧张素Ⅰ向血管紧张素Ⅱ转化，其能降低周身系统血压，扩张肾小球出入动脉，降低肾小球内的压力，延缓肾小球损害，是治疗系膜增生性肾小球肾炎的首选药物〔14〕，因此将贝那普利作为阳性对照药物。本次研究结果说明黄芩苷对大鼠系膜增生性肾小球肾炎具有保护作用；能明显抑制系膜增生性肾小球肾炎大鼠细胞炎症及凋亡。

NLRP3是最佳表征的细胞内受体，在免疫和炎症中起着至关重要的作用；其激活后，NLRP3经历构象变化并与称为凋亡相关斑点样蛋白(ASC)相互作用〔15,16〕，ASC又通过caspase活化和募集结构域将NRLP3桥接至天冬氨酸蛋白水解酶-1前体(procaspase-1)，进而激活caspase-1，得到NLRP3、ASC、caspase-1多蛋白复合物，其作为介导半胱天冬酶1自激活的分子平台。caspase-1由无活性的半胱天冬酶-1合成，并在多蛋白复合物(包括ASC和NLRP3，称为炎性体)内通过二聚化和自身蛋白水解活化〔17〕。活化的caspase-1是IL-1β和IL-18释放，细胞死亡所必需的，并且在炎症中起关键作用〔18～20〕。本研究结果说明黄芩苷可抑制系膜增生性肾小球肾炎大鼠肾脏NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达进而抑制NLRP3/caspase-1通路的激活。

综上，黄芩苷能明显抑制系膜增生性肾小球肾炎大鼠细胞炎症及凋亡，其机制可能与黄芩苷抑制系膜增生性肾小球肾炎大鼠肾脏NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达进而抑制NLRP3/caspase-1通路的激活有关。