吴新建 钟永富

(重庆三峡中心医院急救部，重庆 404000)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠状动脉的血管壁易损斑块发生破裂，有继发血栓形成及炎性反应参与的急危重症，具有极高的病死率〔1〕。因此，及时有效诊断AMI是提高患者预后的关键因素。目前，虽然以肌钙蛋白作为代表的心肌损伤标志物在AMI的诊断和预后中具有重要作用，但其准确性并不高，且在多种心血管疾病中肌钙蛋白(cTn)同样会增加〔2〕。因此，找到敏感性和特异性强的标志物，以弥补cTn在AMI诊断中的缺陷非常重要〔3〕。微小RNA(miRNA)作为近些年发现的一类能够在转录水平上对机体基因的表达进行精细调控的非编码小RNA，通过碱基互补配对原则与靶基因的3′非翻译区进行结合进而抑制基因的翻译，在炎症反应、发育和代谢及肿瘤形成等生理过程中发挥广泛的调控作用〔4〕。研究表明，大脑存在某些特定的miRNA，其表达水平和神经功能紊乱密切相关，在脑部发生缺血后脑内一些基因被诱导或抑制，可能与miRNA引起mRNA的降解和翻译过程有关〔5〕。另外，血浆中微小RNA在AMI的发生和发展过程中异常表达，可作为AMI的潜在标志物〔6〕。因此，本研究旨在探讨循环微小RNA与AMI病情及预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年1月至2019年1月在重庆三峡中心医院进行治疗且诊断为AMI的患者80例作为研究组。男50例，女30例；年龄40～79〔平均(63.15±4.68)〕岁。另外，选择60例经冠状造影检查阴性的患者作为对照组，男36例，女24例，年龄40～78〔平均(60.98±4.41)〕岁。3组年龄及性别等一般资料差异均为统计学意义(P>0.05)，有可比性。所有入组人员签署知情同意书，且该研究方案通过医院伦理委员会的批准。

1.2纳入标准 ①患者均持续胸痛达30 min以上；②AMI患者的心肌损伤标志物高于参考区间的上限，其中血清cTnI>0.06 ng/ml或者肌酸激酶同工酶(CK-MB)>16 IU/L；③心电图显示患者具有连续两个及以上导致典型心肌缺血的改变；④冠状动脉造影显示明确的血管病变排除标准：①患者为陈旧性心肌梗死；②患者具有心脏病史，例如心肌炎、心脏瓣膜病和心源性休克等；③合并患有恶性肿瘤、严重肝肾功能不全者及甲状腺功能异常者。

1.3试剂盒仪器 总RNA提取试剂盒及反转录试剂盒购自Trizol公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit购自Ambion公司；QuantiTect SYBR Green PCR Kit购自Qiagen公司；PCR引物购自金斯瑞公司；cTnI ELISA检测试剂盒及肌红蛋白(MB)ELISA检测试剂盒均购自美国R&D公司；胆固醇(TC)检测试剂盒、三酰甘油(TG)试剂盒、CK-MB均购自英国Randox公司；低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)均购自日本第一化学株式会社公司。普通PCR仪及电泳仪及凝胶成像系统均购自BIO-RAD公司；NanoDrop 2000c购自Thermo公司；离心机及恒温水浴箱均购自BIO-RAD公司；荧光定量PCR仪及E601电化学发光全自动免疫分析仪均购自Roche公司；AIA-2000全自动免疫发光分析仪均购自日本东曹公司。

1.4研究方法〔7〕经皮冠状动脉介入(PCI)均由2名以上具有丰富经验的心血管内科医生进行手术。以3条心外膜下冠状动脉和大分支任意段直径狭窄≥50%作为冠状动脉造影阳性，并按照狭窄所累及的血管，分为左主干、左回旋支、左前降支、右冠状动脉分为单支血管病变、二支血管病变和三支血管病变，单纯的左主干病计为二支病变。患者均经冠状动脉造影证实，PCI术前AMI患者冠状动脉主要分支狭窄均≥70%，且PCI术后其相应分支残余狭窄程度≤20%。另外，心肌梗死溶栓(TIMI)的血流分级≥2；患者术后均采用标准药物进行治疗。患者均在就诊2 h内抽取外周静脉血4 ml；对照组均于造成空腹状态下采取外周静脉血4 ml。均采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，且颠倒摇匀，后冻存于-80℃冰箱待用。按照Triol试剂盒说明书抽取患者的外周血标本总RNA。抽提结果运用NanoDrop2000c紫外分光光度计对总RNA进行定量，之后运用1 μg的总RNA按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit的说明书进行逆转录进而合成cDNA，后冻存于-80℃待用。荧光定量PCR反应参照QuantiTect SYBR Green PCR Kit试剂盒的说明书，且以合成的cDNA作为模板在PCR仪上进行实验。反应体系20 μl，体系如下：cDNA 1 μl；上游引物和下游引物各2 μl；2*SYBR premix Ex TagTM II PCR 7 μl；Rnase-free water 9 μl。反应条件如下：95℃ 10 min；95℃ 10 s；65℃ 30 s；72℃ 30 s，40个循环。同时以U6作为内参对照，运用CT值法比较分析各组miRNA的相对表达量。运用7300PCR软件对荧光定量PCR仪采集的信号进行分析，观察引物以及目的基因的标准曲线、扩增曲线。采用2-△△ct法进行相对定量分析，计算各组miRNA的相对表达水平。

1.5生化指标检测 患者的血清生化指标均按照相应自动化分析仪以及试剂盒的说明说进行操作，其中TC采用胆固醇氧化酶法，TG运用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶(GPO-PAP)法，HDL-C和LDL-C运用间接法，运用酶耦联法检测CK，免疫抑制-酶动力法检测CK-MB，cTnI和NT-pro-BNP采用化学发光法检测。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件进行χ2检验、t检验、Pearson相关性分析、Logistic回归分析、受试者工作特征(ROC)曲线。

2 结 果

2.1两组血脂及心功能指标水平比较 与对照组比较，AMI组治疗前血清TG水平显著升高，HDL-C水平显著降低(P<0.05)。与治疗前相比，AMI组治疗后TG、cTnI、NT-pro-BNP、CK、CK-MB显著升高(P<0.05)，TC、GRACE评分显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 两组血脂及心功能指标水平比较〔M(Q25,Q75〕

2.2两组治疗前血清miRNA水平比较 AMI组血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

续表1 两组血脂及心功能指标水平比较〔M(Q25,Q75〕

2.3AMI患者治疗前后miRNAs水平比较 治疗后，AMI患者血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均较治疗前显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组血清miRNAs水平比较

2.4血清miRNAs水平对AMI病情的监测价值 血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210用于监测AMI组和对照组ROC曲线下面积(AUC)分别为0.73(95%CI=0.63～0.82，P<0.001)、0.66(95%CI=0.55～0.76，P<0.001)、0.71(95%CI=0.61～0.81，P<0.001)、0.75(95%CI=0.61～0.83，P<0.001)、0.72(95%CI=0.57～0.79，P<0.001)。

以AMI和对照组的二类变量作为因变量，以血清mRNAs水平、性别、年龄及血脂指标(包括TC、TG、HDL-C、LDL-C)作为自变量，单因素仅纳入miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平。结果提示，miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均于AMI的发生具有相关性。而多因素模型中除了纳入miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平外，还纳入年龄、性别及血脂水平，结果提示：通过矫正性别、年龄及血脂水平，高水平miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210仍然可作为AMI发生的独立预测因素。见表3。

表3 血清miRNAs的单因素及多因素Logistic回归分析

2.5血清miRNAs水平和患者临床参数的相关性分析 AMI组治疗前血清miR146a、miR193a、miR16和miR210水平和cTNI的水平及预后GRACE评分呈正相关；血清miR146a和miR16水平还与TG水平呈正相关，血清miR208b与NT-proBNP呈负相关。见表4。

表4 血清miRNAs水平与临床指标的相关性

3 讨 论

AMI患者由于脑动脉闭塞进而导致脑组织缺血和缺氧，因此产生炎症反应、细胞凋亡及血管再生等病理过程，且神经功能障碍为主要临床表现〔8〕。研究表明〔9,10〕，在患者缺血和缺氧状态下会导致细胞内的mRNAs水平发生变化，miRNA和低氧反应具有密切关系，且多种miRNA参与机体的大脑缺血、缺氧及再灌注损伤中的细胞凋亡。miRNA通过调控机体细胞凋亡基因、血管内皮生长因子及细胞周期基因而发挥作用〔11〕。临床研究表明〔12〕，AMI患者中多种血清及血浆RNAs特异性表达，可作为AMI早期诊断及病情预测的标志物，且AMI患者治疗前后血清中特定miRNAs的水平同样会发生特异性的改变，表明miRNAs还可以作为监测AMI患者PCI 治疗前后的病情变化的潜在标志物。

机体在正常状况下，血液中的一些miRNA处于稳定状态，因此其异常表达有助于疾病的诊断〔13〕。由于外周血的方便性及RNA提取的可操作性，使得人们能够检测miRNA水平来对某些疾病进行早期诊断。本研究结果表明，血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平不仅与AMI的损伤程度呈正相关，同样可作为PCI手术治疗前后患者病情变化的新型标志物。Zhu等〔14〕研究发现，AMI患者PCI 手术后血浆miR181a水平相较于治疗前显著下降。Chen等〔15〕研究发现，AMI患者术后miR499水平相较于手术前显著降低，并且多支冠状动脉患者的miR499水平显著高于单支冠状动脉病变的患者，与本文研究结果相一致。这是兴奋性氨基酸细胞毒性作用机制是脑缺血损伤的病理生理过程的重要环节，在急性脑梗死发生后，在缺血区突触间隙存在大量谷氨酸聚集，最终引起神经元损伤从而造成广泛的的脑组织病理性损害〔16〕。而GLT-1作为一种兴奋性氨酸转运体的亚型，是主要的星形胶质细胞谷氨酸转运体蛋白，其编码基因为SLClA2。在脑梗死后，患者脑组织的miRNAs水平表达升高，并与编码基因SLClA2的mRNA 3′UTR结合，下调mRNA表达，抑制GLT-1蛋白的表达，谷氨酸转运功能障碍，促进神经元损伤〔16〕。

本研究结果表明，miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平可作为AMI的独立危险因素。其中，miR146a通过机体炎症反应参与动脉粥样硬化的发生与发展〔17〕；miR193a-5p可通过促进心脏病患者的心脏微血管的生产〔18〕；miR16在多种癌症及心血管疾病中起重要作用，可明显抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭并促进细胞凋亡〔19〕；miRNA210在促进脑血管缺血后血管新生过程中起到重要作用〔20〕。因此，监测AMI患者血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平能有效评估AMI患者疾病严重程度及PCI术后患者的病情变化。