曹学全，陈丽丽，范广民，蔡小波，阮正英，卢洪胜，杨朝晖

（台州市中心医院（台州学院附属医院），浙江 台州 318000）

甲状腺乳头状癌 （Papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，占所有甲状腺癌的80%-85%[1]。前B细胞白血病同源盒基因 3（Pre-B-cell leukemia homeobox 3，PBX3）属于PBX家族成员。研究表明，PBX3在喉鳞癌[2]、宫颈癌等多种实体瘤中高表达，且其表达水平与肿瘤的病理分级、临床分期等有关，肿瘤恶性程度越高，PBX3的表达越高[3]。最近的一项研究显示，PBX3是结直肠癌上皮-间质转化（EMT）网络的一个重要调节蛋白，有望成为新的预后预测因子[4]。在许多肿瘤的进展中，肿瘤转移往往与EMT发生及上游基因的调控有关。E-cadherin是EMT重要的标志性蛋白，属于钙粘附蛋白家族成员之一，其表达起着抑癌作用，能抑制肿瘤细胞从原发灶向远处转移，其表达异常或缺失能够促进肿瘤细胞的侵袭[5]。目前，PBX3和E-cadherin在PTC组织中的表达及相关性研究鲜见报道，本研究采用Western blot法检测PTC和癌旁组织中PBX3、E-cadherin蛋白表达的差异，并分析表达的临床意义及两者的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年1月-2018年1月在本院行手术切除的PTC标本60例（PTC组），术后病理诊断结果为PTC。所有患者均具有完整的临床和病理资料，且术前未接受放疗、化疗及生物学治疗。同时选取同组癌旁组织（距离肿瘤≥2cm）60例作为对照（癌旁组），经病理诊断为60例癌旁组织均为正常甲状腺组织。收集新鲜的癌和癌旁组织标本，离体后20分钟内放入-80℃低温冰箱保存用于Western blot检测PBX3和E-cadherin蛋白的表达。根据有无包膜侵犯、有无淋巴结侵犯，以及TNM分期分组，分为侵犯组和无侵犯组；转移组和无转移组，以及TNMⅠ-Ⅱ期组和TNMⅢ-Ⅳ期组，不同分组方式的两组间一般资料（年龄、性别及肿瘤长径）比较差异无统计学意义（P>0.05）。详见表1。

表1 三对组别的一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 试剂 T-PER组织总蛋白提取试剂购自Thermo Fisher公司，PBX3兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，E-cadherin鼠抗人单克隆抗体购自英国Abcam公司。辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔及羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 Western blot 取约 25mg组织加入 500μL T-PER组织总蛋白提取液 （含1%PMSF）提取蛋白质，在冰上充分碾磨，10000g离心5分钟，收集上清液。BCA法检测蛋白浓度，取30μg总蛋白进行电泳。SDS-PAGE凝胶进行蛋白分离，湿转法将胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上，用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭 1.5 小时， 加一抗 PBX3（1:500）、E-cadherin（1:1000）和 GAPDH（1:1000）孵育过夜。 HRP 标记的二抗室温孵育1.5小时，用化学发光法（ECL）显色，进行X射线曝光显影，使用软件ImageProplus 6.0分析蛋白条带灰度值，以GAPDH作为内参。

1.3 观察指标 （1）探讨PTC组织、癌旁组织以及PTC患者包膜侵犯组和未侵犯组、淋巴结转移组和无转移组、TNMⅠ-Ⅱ期组和TNMⅢ-Ⅳ期组PBX3和E-cadherin蛋白的表达水平，比较两组蛋白表达水平差异；（2）PTC患者中PBX3和E-cadherin蛋白表达的相关性。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，采用 t检验；计数资料以百分率表示，采用χ2检验。蛋白表达水平的相关性采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 PTC组和癌旁组PBX3、E-cadherin蛋白表达水平比较 PTC组中PBX3蛋白相对表达量高于癌旁组，差异有统计学意义（t=13.868，P<0.01）。 PTC中E-cadherin相对表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义（t=29.690，P<0.01）。 详见表 2。

表2 两组PBX3、E-cadherin蛋白相对表达量的比较（±s）

表2 两组PBX3、E-cadherin蛋白相对表达量的比较（±s）

与癌旁组比较**P<0.01

组别 n PBX3 E-cadherin PTC 组 60 1.53±0.26** 0.45±0.03**癌旁组 60 0.83±0.04 1.02±0.13

2.2 不同组间PBX3、E-cadherin蛋白的表达 根据是否侵犯包膜分组，侵犯组PBX3相对表达量高于无侵犯组，E-cadherin相对表达量低于无侵犯组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；根据有无淋巴结转移进行分组，转移组PBX3相对表达量高于无转移组，E-cadherin相对表达量低于无转移组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；根据TNM分期进行分组，TNMⅢ-Ⅳ期PBX3相对表达量高于TNMⅠ-Ⅱ期组，E-cadherin相对表达量低于TNMⅠ-Ⅱ期组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。 详见表3。

表3 不同分组方式两组间PBX3、E-cadherin蛋白的相对表达量（±s）

表3 不同分组方式两组间PBX3、E-cadherin蛋白的相对表达量（±s）

与无侵犯组比较#P<0.05，##P<0.01；与无转移组比较△P<0.05，△△P<0.01；与 TNMⅢ-Ⅳ期组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01

组别 n PBX3 E-cadherin侵犯组 27 1.76±0.45# 0.46±0.03##无侵犯组 33 1.52±0.28 0.50±0.05转移组 40 1.74±0.41△ 0.44±0.03△△无转移组 20 1.48±0.23 0.49±0.05 TNMⅠ-Ⅱ期组 46 1.47±0.12▲ 0.51±0.06▲▲TNMⅢ-Ⅳ期组 14 1.73±0.53 0.45±0.03

2.3 PTC组织中PBX3与E-cadherin蛋白表达的相关性 Pearson相关分析显示，PTC组织中PBX3蛋白相对表达量为 1.5324±0.2643，E-cadherin蛋白相对表达量为 0.4472±0.0263，PBX3、E-cadherin蛋白表达水平呈负相关（r=-0.396，P＜0.05）。

3 讨论

PBX3属于PBX家族成员之一，作为细胞内转录因子在哺乳动物细胞发育、进化过程中发挥重要作用[3]。据报道，PBX3在许多实体瘤以及一些血液系统恶性肿瘤中过表达，且促进细胞存活、侵袭和增殖[6-7]。本研究结果发现，PTC组织中PBX3蛋白表达水平显著高于癌旁组织，提示PBX3蛋白表达上调在PTC的发生中起促癌作用。同时研究结果还发现，PBX3表达与PTC的包膜侵犯、淋巴结转移和临床分期密切相关，提示PBX3蛋白表达水平升高在PTC的发生、发展过程中起促进作用。国内学者在宫颈癌研究中也发现，PBX3蛋白在宫颈癌组织中的表达水平升高，且表达水平与宫颈癌患者的临床特征显著相关，在宫颈癌的发生、发展以及预后评估中有着重要的临床意义[8]。分析其机制，可能与PBX3特异性结合靶RNA的编码区、激活RNA的翻译、并在转录后发挥促进作用有关。PBX3对血管生成有明显的促进作用，进而参与癌细胞增殖、浸润和转移[9]。新的机制研究发现，PBX3对p21转录的调控是通过p21的上游调节因子，即肿瘤抑制因子p53来实现的，表明PBX3通过调节p53/p21轴来调节肿瘤生长，参与肿瘤的进展[10]。

E-cadherin是钙黏蛋白家族的成员之一，是细胞间粘附连接的主要组成部分，该连接可维持细胞-细胞间粘附、细胞极性和上皮组织稳定性，从而抑制细胞运动和恶性肿瘤进展[11-12]。Niknami等[13]发现，Vimentin的表达随着肿瘤分级、病理分期和区域淋巴结转移的增加而增加，在伴有血管侵犯的癌中，波形蛋白值较高。相反，E-cadherin表达随着肿瘤分级、病理分期和TNM分期的增加而降低。本研究结果显示，E-cadherin在癌旁组织中的表达高于PTC组织，随着PTC伴有包膜侵犯、淋巴结发生转移和较晚的临床分期，E-cadherin表达水平进一步下调，其可能机制与上游基因调控后（包括转录抑制和甲基化等），上皮细胞表面黏附分子表达水平改变（包括E-cadherin表达下降或缺失等），导致细胞形态异常、失去极性及黏附性，进而获得间质细胞的某些特征有关[14]。

本研究还探讨了PTC中PBX3与EMT标志物E-cadherin的关系，Pearson相关性分析结果显示，PTC中PBX3和E-cadherin蛋白表达水平呈负相关。有研究显示，胃癌细胞中PBX3过表达降低了上皮细胞的生物标记物E-cadherin的表达，增加了间充质细胞的生物标记物N-cadherin和Vimentin的表达。结果表明，PBX3的过度表达通过诱导EMT促进胃癌细胞的侵袭和转移[15]。综合以上文献报道及本实验结果可以推测，PBX3高表达可能通过抑制E-cadherin的表达介导EMT，进而促进PTC发生包膜侵犯和淋巴结转移。