蔡霓，闫多子，农向群，王广君，涂雄兵，张泽华

绿僵菌2敲除株构建及其生物学和诱导植物响应的功能分析

蔡霓，闫多子，农向群，王广君，涂雄兵，张泽华

中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

【目的】昆虫病原真菌绿僵菌兼具植物内生性。已知黏附素MAD2是绿僵菌两种黏附蛋白之一，在实现绿僵菌与植物的黏附、定殖中起重要作用，但其作用机理知之甚少。本研究通过构建金龟子绿僵菌（）2敲除突变株（Δ2），探究MAD2蛋白对绿僵菌生物学功能的影响。【方法】从NCBI中获取2前后基因组DNA序列，设计扩增2前后同源臂特异性引物，以绿僵菌基因组DNA为模板，扩增得到前后同源臂基因S1、S2；设计特异性引物Hyg-F/R，以pKH-KO载体为模板，扩增得到带有启动子序列的潮霉素基因；再通过overlap PCR构建2的同源敲除盒S1H、S2H；最后利用PEG介导的原生质体转化，获得稳定遗传的2敲除株。通过对比敲除株与野生株（WT）的生长特性、黏附作用、杀虫毒力以及诱导花生共生基因转录水平的变化，分析MAD2蛋白的生物学功能。【结果】原生质体转化获得了敲除2的同源重组转化子；敲除株与野生株对比分析表明，敲除株的孢子萌发率显著低于野生株，萌发中时间比野生株延长5.47 h；培养12 h和14 h时，敲除株的菌丝长度显著均小于野生株，分别为野生株的77.8%和76.3%；培养12 d的产孢量也比野生株减少33.3%。敲除株对洋葱内表皮的黏附力明显降低，但对蝗虫后翅的黏附性无显著影响。敲除2并不影响绿僵菌对家蚕的毒力。……