周爽 廖华

1 武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科(武汉 430060)

神经营养因子是影响神经元发育和维持神经可塑性的重要因子，胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)是由胶质细胞衍生的神经营养因子，是一种糖基化、二硫键结合的同型二聚体蛋白，是转化生长因子-β超家族的成员，具有支持神经元的生长，助于神经元的存活和分化，并抑制细胞死亡的作用，可以保护听觉系统的感觉细胞免受噪声的破坏等[1]。因GDNF对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元等明显的神经营养作用，目前已经成为治疗帕金森病、肿瘤等疾病的研究热点[2,3]。在胚胎发育和成熟动物的耳蜗神经元及毛细胞内均检测到GDNF的mRNA和蛋白的表达，而GDNF的表达量在噪声损伤和缺血等情况下升高，证明其潜在的内源性神经营养因子保护作用[4]。GDNF在与听觉系统相关的组织中均有表达，如下丘、海马、上橄榄复合体等，目前关于GDNF在听觉系统等神经营养作用的研究成为热点，并可能有助于临床治疗内耳疾病，本文对GDNF在听觉系统相关组织中的作用进行综述。

1 GDNF概述

GDNF在细胞内信号传导过程中，首先结合锚定的糖基磷脂酰肌醇GDNF家族受体α1(GDNFRα1，GFRα1)，随后与跨膜酪氨酸激酶受体(rearranged during transfection，RET)和神经细胞粘附分子(nerve cell adhesion factor, NCAM)结合，诱导细胞内信号传导[5]。GDNF通过与RET和细胞表面结合共受体发出信号，形成GDNF/GFRα/RET复合物，使RET活化，引起RET蛋白受体磷酸化并使RET进入激活状态，被激活的RET将磷酸化其底物，造成下游信号通路的激活。RET蛋白参与的信号通路包括PI3K-AKT-mTOR途径及RAS-RAF-MEK-ERK途径。PI3K-AKT-mTOR途径参与细胞存活和多巴胺能神经元促生长和分化作用， RAS-RAF-MEK-ERK途径参与细胞增殖和促神经元存活和突触生长作用，因此，RET蛋白在细胞存活、迁移、增殖上均有一定的作用[6]。在早期发育中，GDNF-RET信号通路促进神经细胞的增殖和迁移，从而促进神经内分泌器官的生长，并促进神经系统和周围神经系统的发展。研究显示，在噪声或耳毒性药物损伤后，应用外源性重组或病毒表达的GDNF对于内耳具有保护作用并可保存一定的听力，证明GDNF在听觉系统具有明显的神经营养作用[7]。

2 GDNF在听觉系统中的作用

2.1GDNF在耳蜗中的作用 在大多数听力损失病例中，毛细胞受损或缺失，严重损害了声音感知[8]。耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron,SGN)是传导听觉信息的一级神经元, 噪声、感染、耳毒性药物和衰老等诸多因素直接或者间接使螺旋神经节神经元受损,导致感音神经性听力损失,而哺乳动物螺旋神经元的再生能力非常低,因此保护螺旋神经元或者修复受损的螺旋神经元对恢复听力有关键性的作用。神经营养因子是神经细胞存活的依赖因子,是成熟神经元功能的调控因子,也是神经元受损和病变损伤时保护和促进其再生的必需因子[9]。Euteneuer等[10]通过对体外新生和围生期大鼠听觉系统主要神经元即螺旋神经节细胞的研究，发现发育中小鼠螺旋器中RET和NCAM 传入树突神经支配增加，GDNF/GFRα1信号通路刺激激活细胞内PI3K/AKT和MEK/ERK信号级联反应，外源性GFRα1增强GDNF对大鼠围生期神经突触数量的刺激作用，GDNF/GFRα刺激大鼠螺旋神经节外植体诱导AKT和ERK磷酸化，抑制这些信号传导途径减少了GDNF/GFRα1诱导的轴突生长，GDNF/GFRα1均在体外刺激SGN轴突数。GDNF/GFRα1刺激激活AKT和MEK/EEK信号传导，同时抑制这两个信号传导级联也会抑制GDNF的体外作用。此实验证明GDNF信号通路通过与其受体NACM结合，对于出生后螺旋神经节(spiral ganglion, SG)具有明显的神经营养作用。

Akil等[11]通过新生小鼠的圆窗膜将编码腺相关病毒载体血清5(adeno-associated virus vector serotype 5, AAV-5)载体转导入内耳后，在内毛细胞和SGN中观察到强烈的GDNF受体的表达；GDNF表达出神经营养蛋白，用于转导毛细胞和SGN。而高浓度AVV-5注射的新生小鼠观察到严重的神经系统损伤(震颤、协调不良、共济失调、尾巴畸形等)和重度听力损失，而应用1:10和1:20稀释的AVV-5注射液后未出现上述症状；14日龄小鼠在注射高浓度AAV-5后未引起上述变化，说明GDNF在小鼠幼年期作用明显。该研究显示，GDNF可以在创伤后长达6周的实验性聋大鼠耳蜗内显著减少螺旋神经节神经元的继发性退化[11]。GDNF的干预导致螺旋神经节神经元维持电响应性，表现为电诱发听性脑干反应的刺激阈值明显降低；在没有GDNF干预的情况下，耳聋大鼠螺旋神经节细胞持续丢失，伴随着电反应性的降低，表明螺旋神经节细胞密度与电反应阈值之间存在很强的相关性。

Harasztosi等[12]使用lacZ敲入等位基因，证实了GDNF在小鼠耳蜗中的表达，包括在发育过程中的感觉区域。通过基因敲除抑制小鼠毛细胞和/或听觉神经元中GDNF的表达，发现GDNF表达对于维持听觉系统不同水平的功能性听力具有重要作用。为验证GDNF对失神经支配的SGN的神经保护作用，有学者通过对豚鼠注射耳毒性药物，造成毛细胞失活，然后通过耳蜗内注射5 μl AdGDNF，饲养1到2月后对其内耳SG细胞进行计数，结果显示注射GDNF的豚鼠相对未注射者SG细胞存活率明显增加。运用GDNF加电刺激对全聋豚鼠的SG神经元存活率较单种处理方式更高，并推测GDNF和电刺激的运用有助于人工耳蜗植入患者的听觉恢复[13]。

听觉器官中的内、外毛细胞以及螺旋神经节神经元对于维持正常的听力都是必不可少的，人工耳蜗的开发和临床应用表明，单独的螺旋神经节神经元在与电刺激结合时可能起重要作用。因此，人工耳蜗植入者保持适当功能的螺旋神经节神经元群非常重要；然而，人类螺旋神经节神经元的继发性变性发生在毛细胞受损后的数年之内，因此，到最终选择人工耳蜗可能需要相当长的时间；而豚鼠神经变性的过程要快得多，在感觉性毛细胞丢失的几周内就可以检测到电反应性明显降低，这使得豚鼠模型可用于关于增强螺旋神经节神经元的存活和功能并因此改善人工耳蜗植入的功效的研究[11]。

综上所述，GDNF对于维持SGN的功能进而维持听觉系统的功能具有重要的支持及营养作用，尤其是幼年期，对于耳蜗疾病的治疗可能存在巨大的应用前景。

2.2GDNF在下丘中的作用 下丘是听觉信息突触传递的重要部位，它代表特定的听觉处理区域，向听觉丘脑和听觉皮层提供所有脑干预处理的听觉信息，它还代表了一个感官信息分析站点，输入大量下行信息[14]。既往有研究显示噪声刺激下耳蜗内多巴胺降低,长时间强噪声暴露下大鼠脑内多巴胺的含量也是降低的[15,16]。GDNF能够支持多巴胺能神经元的生长和存活，可通过激活RET的多组分受体复合物和GDNF家族来促进多巴胺能神经元的生存和分化。研究表明，颅内输注GDNF和腺相关病毒编码的GDNF均增加了18氟-多巴胺的摄取，提示GDNF在治疗帕金森病患者时对多巴胺能神经元具有明显的营养作用[17]。

Wissel等[18]运用氨基糖苷诱导大鼠耳聋后，发现耳聋大鼠下丘中GDNF家族的所有成员及其受体的基因表达模式受到低水平调控，但无统计学意义，而耳聋大鼠听觉神经中GDNF及其受体GFRα1和RET表达量明显增加，证明GDNF在毛细胞受损后对听觉神经具有重要的保护作用；作者推测GDNF表达量增加的原因为剥夺性上调从而形成对听觉神经细胞的保护作用,内源性的GDNF通过过表达来维持听觉神经的稳定，但内源性神经营养因子的过表达无法满足长期维持听觉神经稳定的需要，说明神经营养因子通过复杂的信号通路影响细胞存活和凋亡的平衡。

王苹等[19]将脂肪间质干细胞与胚胎中脑细胞共培养7 d后，通过酪氨酸羟化酶免疫荧光染色确定多巴胺能神经元的存活，发现脂肪间质干细胞共培养组酪氨酸羟化酶阳性细胞明显多于单纯多巴胺能神经元培养组，说明脂肪间质干细胞本身可能分泌某些营养神经的因子，抑制了多巴胺能神经元的延迟性死亡。其通过进一步实验，将脂肪间质干细胞经GDNF基因修饰后，再与多巴胺能神经元共培养，发现多巴胺能神经元存活率更高，说明GDNF对于多巴胺能神经元的存活具有重要的营养支持作用。

GDNF不仅对多巴胺能神经元具有营养、支持及保护作用，对于神经前体细胞向多巴胺能神经元的分化也具有促进作用。因此，对GDNF在下丘内多巴胺能神经元的营养、支持作用的研究，对于临床上治疗下丘相关的听觉系统疾病等具有一定的应用前景。

2.3GDNF在上橄榄复合体(superior olivary complex，SOC)中的作用 上橄榄复合体是接受耳蜗核听觉上行传导通路纤维的脑干初级听觉中枢，由四个亚核组成：外侧上橄榄核、内侧上橄榄核、橄榄周核和斜方体核，其与脑干其他核团，如：外侧丘系核、内侧膝状体、下丘、耳蜗核等都有复杂的联系，上橄榄内侧核和外侧核细胞可识别双耳传来的信号中的强度差和时间差[20,21]。研究显示，射频暴露可造成海马、小脑内神经元的神经损伤。Maskey等[22]通过对小鼠进行835 MHz射频辐射3个月后，发现GDNF作为保护因子，其免疫反应性在SOC中明显降低，表明GDNF在射频暴露后其神经营养支持作用发生了改变，可能会影响中枢听觉系统的功能。因此，GDNF对于SOC这一初级听觉中枢亦具有神经营养作用。

3 GDNF在耳鸣中的作用

耳鸣是指在没有外界声音刺激下的声音感知，其发生机制不明确且错综复杂。越来越多的研究证明，对耳鸣的适应高度依赖于神经可塑性和功能失调的听觉通路恢复。研究显示听觉通路的任何部位异常，包括蜗神经、听神经或中枢听觉传导通路等均可导致耳鸣[23]。对人体的神经影像学研究显示边缘系统可能在耳鸣的非中枢听觉传导通路其他区域起主要作用。在动物模型中，耳鸣伴有进行性再生的神经回路的重塑，对耳鸣的反应与神经营养因子的表达相关，这激发了人们对使用这些因子治疗耳鸣的兴趣[24]。神经心理学研究显示压力和负面情绪可能增加对耳鸣的感知，边缘系统在慢性耳鸣的病理生理学机制中不可或缺；海马和海马旁区域的记忆/认知机制在耳鸣持续感知、焦虑、困扰中有重要作用。研究显示，在边缘系统参与耳鸣的进程中，可产生负面认知和情绪，并将患者的注意力聚集到耳鸣上，从而形成了耳鸣和负面情绪的恶性循环[25]。

成年的颗粒细胞(granular cell， GC)在正常生理条件下有助于认知过程，例如学习记忆和认知等。有研究证明神经系统疾病和情绪障碍对成年海马神经元具有有害作用，因听觉系统和边缘系统是相通的，耳鸣的声音会影响边缘系统的情绪和认知功能。杏仁核和海马是两个主要的直接或间接接收从中枢听觉系统输入神经元的区域[26]；反过来，从边缘系统到听觉脑区有直接或间接的能够影响神经元活动或调控突触可塑性的映射。Bonafina等[27]研究表明GFRα1是新生GC成熟所必需的，这对于空间记忆至关重要，并且会触发内源性GDNF表达。因此，GDNF/GFRa1复合体代表了一种关键介体，它将运行活动与空间记忆所需的结构可塑性和突触整合的控制联系在一起。GFRα的缺乏导致小鼠的空间记忆处理能力下降，而GDNF/GFRα复合物介导活动诱导成人GC的重塑；可见，GDNF对于耳鸣的情绪和认知是一种重要营养因子。

γ-氨基丁酸(GABA)及其受体介导了中枢神经系统大多数突触抑制，GABA受体的正常数量和功能对于维持兴奋性和抑制性神经传递之间的平衡至关重要[28]。耳科疾病，尤其是耳鸣，伴随着GABA能系统的紊乱，小样本临床研究表明，GABA受体激动剂苯二氮卓类药物可有效降低耳鸣评分，证明GABA受体异常可能是耳鸣发展的基础[29]。Wu等[30]通过水杨酸钠注射致大鼠耳鸣，研究大鼠中枢神经系统GABAA受体结合和代谢活性的影响，结果发现， GABAA受体结合增强，代谢活性增加，且听觉和边缘系统都参与了水杨酸钠诱导的耳鸣，增加的神经活动可能是耳鸣形成的基础，而增加的GABAA受体结合可能涉及耳鸣的环节。Koelsch等[31]发现胸腰部脊髓伤2小时后，脊髓注入编码GDNF的疱疹病毒基载体可在伤后5周内持续改善运动功能，体外向初级脊髓神经元中添加重组GDNF蛋白可通过MEK-ERK途径增强神经突生长、突触连接和GABA能神经传递。

Martin和Raphael等[32]研究发现，GDNF基因过表达可对耳鸣进行相对有效的治疗。Orenay-Boyacioglu等[33]研究慢性耳鸣与GDNF多态性(rs884344，rs3812047和rs1110149)之间的关系，以确定它们在耳鸣的病理生理作用，通过对耳鸣患者GDNF基因rs1110149多态性的研究显示，其杂合性相对于正常人显著降低；而由于样本量较小，尚无法检测到耳鸣与GDNF多态性之间的相关性，说明GDNF基因在不同的组织和病理中具有可变的表达模式。Sand等[34]研究耳鸣患者中编码GDNF基因的遗传变异，结果显示，GDNF和BDNF基因多态性与耳鸣严重程度有关，且GDNF变体可能有助于评估明确定义的耳鸣亚群中症状控制的潜力。目前因耳鸣机制的不确定性导致耳鸣的治疗成为难题，GDNF在耳鸣机制中的作用研究有可能对治疗耳鸣取得进一步进展。

GDNF存在于中枢与外周听觉系统中各个部位，对于突触可塑性具有重要的保护作用，而对于GDNF在耳鸣发生发展中作用的研究将有助于提高对耳鸣的认知并发现可能的治疗方案。

4 总结

GDNF是重要的神经营养因子，具有广阔的神经营养作用，能够支持神经元的存活，影响神经元的发育和分化，且对多巴胺能神经元有高度的亲和力并能促进其存活。目前研究证明GDNF在听觉系统中耳蜗毛细胞、下丘、上橄榄复合体、听神经等都有表达且具有重要的营养保护作用，GDNF在海马的记忆认知功能中也有重要作用，其对于耳鸣的发病机制研究具有广阔的前景。然而，目前对于GDNF在听力学相关疾病中的具体作用机制和未来的治疗前景仍需要进一步探究。