张李婷 高春侠 陈 鸣 杨 爽 马文兵②

嵌合抗原受体 (chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T(CAR-T)细胞疗法发展迅速，在治疗恶性肿瘤，特别是血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大的成就。但是伴随着对血液肿瘤显著疗效的同时，CAR-T细胞疗法也存在着一些问题，如脱靶效应、细胞因子风暴、插入突变等，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。CAR修饰的自然杀伤(natural killer,NK)细胞由于可以避免这些缺点而备受关注。目前，临床前和临床研究表明，CAR-NK细胞疗法可能具有显著的抗肿瘤作用，相较于 CAR-T 细胞疗法，CAR-NK细胞疗法可补足相关劣势，可以靶向多种致病性抗原，具有更强的细胞毒性，并且可以被更好地控制，极大地减轻细胞因子风暴的风险。此外 NK 细胞来源广，并不需要依赖患者自身特异性免疫细胞[1]。然而，CAR-NK细胞疗法仍然面临着一些研发挑战，如原代NK细胞的体外扩增和激活，NK细胞产品的储存和运输困难，转导效率低等。同样，在临床转化中也出现了潜在的伦理问题，如临床试验中所涉及的潜在利益和风险，以及研究人员个人学术发展和患者利益之间的平衡。因此，研究人员应在坚持保护患者权益等伦理原则的基础上，探讨CAR-NK细胞疗法在临床转化中的伦理问题，对提高治疗效果具有重要意义。

1 CAR-NK细胞疗法概况

NK细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，占外周循环淋巴细胞的10%～15%，细胞表型为CD56+CD3-，根据细胞表型及功能分成两个亚群：有杀伤活性的CD56dimCD16+(约占90%)和具有免疫调节作用的CD56brightCD16-亚群(约占10%)。在循环系统中的 NK 细胞通常处于休眠状态，一旦被激活，它们会渗透到组织中，分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，攻击肿瘤细胞。而这一动态平衡主要受 NK 细胞表面受体蛋白的调控：杀伤细胞活化受体和杀伤细胞抑制受体。NK 细胞的活化状态，执行细胞的脱粒、细胞因子释放和细胞杀伤功能是抑制信号和活化信号综合的结果[2]。

CAR-NK又称为加强版的NK细胞，是通过基因工程手段修饰使其表达CAR，将识别肿瘤细胞表面抗原的抗体(或受体)与激活免疫细胞所需的信号分子连接，可以突破抑制受体的限制而激活NK细胞，以增强NK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。CAR-NK细胞疗法流程是：首先抽取患者或健康供者外周血，分离、获得外周血单个核细胞，然后在体外大量扩增NK细胞；其次通过基因工程修饰，在NK细胞表面表达能够和肿瘤特定抗原结合的CAR；最后回输至患者体内，能够特异性识别带有特定抗原的肿瘤细胞，引发免疫反应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。CAR-NK细胞疗法目前还处于试验研究阶段，在临床前和临床试验中已被证明可以杀死血液和实体肿瘤细胞，显示了其作为一种具有广泛临床应用前景的现成产品的潜力[3]。本文重点介绍了临床前向临床转化、提高CAR-NK细胞疗法安全性和有效性的新策略，并描述了CAR-NK细胞疗法临床转化面临的挑战。

2 CAR-NK细胞疗法临床转化中面临的问题

2.1 CAR-NK细胞疗法临床转化风险/获益伦理困境

2.1.1 CAR-NK细胞疗法临床转化面临的风险

CAR-NK细胞疗法虽然具有巨大的潜力，但要扩大其临床应用，仍有一些根本性的问题需要解决。首先，目前的CAR是为构建CAR-T细胞而设计的，因此不是应用于NK细胞的最佳选择。CAR结合表位的位置及其与CAR-NK细胞表面的距离影响其结合抗原和激活CAR-NK细胞的能力[4]。其次，外周血NK细胞的使用受到限制，因为原代NK细胞通常很难进行基因修饰；因此，即使使用病毒载体，转导效率也非常低，而且在过继转移设置下，同种异体NK细胞只能存活几周，限制了它们的抗肿瘤效果[5]。再者，NK细胞对冻融过程敏感，解冻后NK细胞的存活率和细胞毒性显著降低[6]。体内注射后曾表现出较差的扩增和持久性，成熟的人NK细胞寿命有限，半衰期估计为14天[7]，这限制了它们的临床效果[8]。最后，异基因NK细胞可能被T细胞污染，导致移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)或淋巴增殖障碍[9]。对于CAR-NK细胞疗法在临床转化中存在的上述安全问题，还需要大量研究，进一步建立质量监管规范。

2.1.2 CAR-NK细胞疗法无普遍适用的风险/获益评估标准

对于CAR-NK细胞疗法临床研究的风险/获益评估，目前还没有普遍适用的标准。就抗肿瘤的效果而言，其应用于人体Ⅰ期临床试验的获益尚不明确。Shimasaki等[10]发现经CAR-NK细胞疗法治疗后，异种移植白血病的生长速度明显减慢。近期，来自德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心等机构的研究人员在《新英格兰医学杂志》上公布了美国首个CAR-NK细胞临床试验(NCT03056339)的结果。研究显示，用脐带血来源的CAR-NK细胞疗法治疗既往接受过大量治疗的复发或难治性非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病患者后，大多数患者产生了治疗效果，且未出现主要的毒性作用。在参与该研究的11位患者中，有8位(73%)对治疗有反应，其中7位完全缓解，这意味着他们在中位随访13.8个月时无疾病进展。输注后1个月内CD19对CAR-NK细胞疗法的反应明显，并且在输注后1年内确认了这项治疗的持久性[11]。但是该研究中11名患者均使用新鲜回输的NK细胞，若想真正成为一种“现货型”的产品，研究者还需确认冻存后的细胞是否可以达到相同的疗效。CAR-NK细胞疗法目前不仅对血液肿瘤有效，还对实体肿瘤的治疗显示出巨大的前景。

尽管在大多数的抽象意义上，客观疗效可能不等同于“获益”，但能被外部标准所接受，是一项衡量变化的客观指标。此外，参与Ⅰ期临床试验的患者除了肿瘤的明显缩小，可能还有其他的获益，尽管这些获益很难被记录。一些研究者观察到参与Ⅰ期肿瘤临床试验的患者生存质量在参与试验的过程中得到改善，但这些研究的设计者并不清楚生活质量的改善是否与药物本身有关，或者与Ⅰ期临床试验过程中与医务人员的频繁接触(因此而获得更多的控制症状的机会)有关，或者与入组患者抱有希望从试验中获益的心理状态有关。

风险/获益的另一个方面是初次接受新的治疗方案的患者可能出现严重的副作用。一个特定的治疗方案在进入Ⅰ期临床试验时，由于没有应用于人体的数据供参考，其风险并不能准确量化，必须用大量的临床前数据以及良好的试验设计(安全初始剂量、小心的剂量递增、实时安全监测)来降低风险。有临床研究表明，由于CAR-NK细胞疗法对CD19+肿瘤细胞的特异性杀伤力，治疗后小鼠的肿瘤负担明显降低，但只有短暂的抗肿瘤作用，后期出现复发[10]。因此，基于上述客观数据，CAR-NK细胞疗法存在的上述安全问题还需要大量研究，进一步建立该疗法风险/获益评价体系。

2.2 CAR-NK细胞疗法准入不严和研究者能力不够

随着CAR-NK细胞疗法技术的快速发展，越来越多的医疗机构和研究人员加入到这一疗法的探索中。CAR-NK细胞疗法制备工艺复杂，过程中的无菌操作、细胞纯度、制备成品安全性等质量控制对后期的疗效有着重要影响，所以确保生产过程的标准化和自动化，做到药效和风险可控是首要任务。研究平台条件是否达标将直接影响着治疗效果，如果入院标准较弱，其所用设备不符合规定的细胞免疫治疗技术要求，不仅会使患者错过最合适的治疗机会，也违反医德原则中的无害原则，如2016年的“魏则西事件”以及2017年第一例CAR-T细胞疗法医疗纠纷案件。面对更多尚未普遍应用于临床的医学创新，如何厘清研究机构所应承担的责任迫在眉睫，亦应在科研探索、产业发展、医学伦理与患者安全之间做权衡。

CAR-NK细胞疗法已被作为新的抗癌利器应用于临床试验，研究成果也日益丰富，但其有效性和安全性大多仍处在论证阶段，个别患者在细胞免疫治疗方面差异很大，存在出现严重并发症的较高风险，如果研究人员专业水平低，他们可能无法充分预测和解释患者的潜在风险并在意外情况下做出及时的专业判断，从而无法保证患者的安全。如果降低科研人员的道德准入要求，只一味追求研究成果，无视患者利益，或者不告知患者治疗过程中面临的风险，或者未经同意就公布研究数据，则严重违反公平正义、尊重自主隐私的伦理原则。

2.3 CAR-NK细胞疗法监管制度缺陷

细胞治疗，既涉及到细胞制品的制取，又涉及到临床应用，该作为“药品”还是“技术”来监管，多年来争论不断。我国在过去几十年里一直在探索适合国内情况的细胞疗法监管策略，但相关的伦理规范建设并不完善。美国、欧盟、日本对于细胞治疗产品的概念界定的侧重点各有不同，美国注重界定制药方式；欧盟侧重于临床应用范围，可用于疾病的预防、诊断或治疗，并且强调了处理方法和生物学特性；日本则强调了细胞的来源为自体或同源，对细胞进行的人工基因操作技术和主要用于治疗与再生修复。目前，我国对于细胞治疗产品存在两种不同监管路径，一种是按照药品申报，在药监局申请下开展规范的注册临床试验；另一种是以第三类医疗技术的形式开展临床试验，属于卫生部门管辖，无须向药品监管部门备案。目前我国大多数细胞治疗的临床研究仍是以第三类医疗技术的形式开展的非注册临床研究，在开展临床研究前并未向药品审评部门提交过临床试验申请。这种“双轨制”管理使得细胞治疗产品权责归属不清的状况带来诸多混乱和风险，该风险最终又是由患者来承担。

2019年卫健委发布的《体细胞治疗临床研究和转化应用管理办法(试行)》指出，体细胞疗法在临床上的应用可以直接应用于患者。这可能会使得医院向患者使用不安全和无效的干预措施。在大多数情况下，细胞疗法的市场应用比临床应用的批准需要更多关于安全性和有效性的数据。因此，制药公司几乎没有动力投资于昂贵的晚期临床试验[12]。通常情况下，细胞治疗临床试验需要有严重疾病的患者作为受试者。在公众意识和参与度较低的情况下，很难招募足够的受试者进行细胞治疗临床试验。医疗机构进行的临床体细胞研究和应用将进一步抢夺制药公司的临床学科资源，并可能阻碍体细胞治疗的进展。

3 CAR-NK细胞疗法临床转化伦理问题的解决措施

3.1 规范CAR-NK细胞疗法临床转化流程

CAR-NK制备工艺复杂，过程中的无菌操作、细胞纯度、制备成品安全性等质量控制对后期的疗效有着重要影响，所以确保生产过程的标准化和自动化，做到药效和风险可控是首要任务。

首先，确保NK细胞来源的安全性。NK细胞来源广泛，如外周血、脐带血、人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞和NK细胞系，细胞来源和临床程序必须符合所有适用的法律、法规和道德要求。CAR-NK细胞疗法中NK细胞需要在体外进行处理，并采用回输过程，保证细胞来源、治疗和质量控制的准确性，才能有效地符合医学伦理学中的无伤害原则。因此，具体的试验方案应该按照共同的指导原则进行规范。必须确定非细胞系的特定来源，还应提供细胞类型、细胞形态以及与标记相关的确切信息。同种异体细胞的免疫治疗需要详细的免疫学检测方法和结果。此外，NK-92等细胞还需要了解其病史、亲本文库的子代数量和允许代数，并保持其细胞表型和功能稳定性。如果要在体外培养细胞，则需要对细胞培养和检测进行严格的监测。确保用于CAR-NK细胞疗法的NK细胞的高质量，可以避免违反无害的伦理原则。

其次，确保NK细胞存活时间。NK细胞在体内存活时间较低，限制了它们的抗肿瘤效果，合适的NK细胞亚群的选择性扩增及其在合适类型肿瘤中的应用值得探讨。脐带血来源的NK细胞或记忆样NK细胞比外周血来源的NK细胞寿命更长，因此可能是NK细胞治疗的理想来源。联合应用细胞因子如白细胞介素-12(inter leukin-12,IL-12)、IL-15和IL-21可能进一步增强这些NK细胞在体内的增殖和持久性[13]。研究表明，引入可诱导的caspase 9自杀系统和小分子二聚体可以诱导CAR-NK细胞凋亡，降低风险[14]。尽管如此，这种方法的必要性还需要在更多的研究中得到验证。

再次，设计适合NK细胞的CAR结构。CAR是提高NK细胞杀伤活性的有力工具，然而，仅有少数研究设计了基于NK细胞特性的CAR结构。因此，设计适合NK细胞的CAR优化结构，才能有效地促进了NK细胞的体内扩增和存活，提高CAR-NK细胞疗法的疗效。有学者构建了9个专门用于NK细胞杀伤黑色素瘤的CAR，特别是聚焦于细胞内刺激适配分子，以寻找NK细胞激活和细胞毒性的优化CAR结构[15]。

从次，提高NK细胞转导率。目前常见的可以用来转染NK细胞的病毒基因载体主要包括：逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、仙台病毒等。逆转录病毒以及慢病毒是CAR-NK细胞构建过程中比较常用的载体，慢病毒转导效率低，非病毒载体克服了这些缺点，被认为是一种安全和负担得起的转导选择[2]。

最后，确保NK细胞解冻后存活率。NK细胞解冻后存活率和活性降低问题，一些研究团队发现，通过添加IL-2可以部分恢复冷冻NK细胞的活性[1]。为了使CAR-NK细胞疗法作为现成的产品具有可行性，必须探索最佳的冷冻保存策略。

只有规范CAR-NK细胞疗法临床转化全流程，以上技术问题能够解决，才可能最大程度地避免受试者受到不必要的伤害。另外，CAR-NK细胞疗法临床研究转化过程需要由受过完整的科研训练、能胜任此工作的人员来指导，尤其对于那些在研究过程中有可能会给研究对象带来伤害的研究更需要研究者进行周密的设计，以尽量避免伤害。研究者也应了解，一旦预先估计研究对象在参与研究的过程中有可能受到生理上的伤害、心理上承受压力或者有可能致伤、致残，甚至致死时，应随时停止研究。以患者为试验对象时，受试对象只限于患者所患疾病的范围内，否则是违反伦理的；以健康人为受试对象时，应保证受试者的健康不会受到损害。

3.2 提升CAR-NK细胞疗法研究人员职业素养

科研平台是高水平科研工作的基础条件，因此加强医疗机构准入管理，是保证CAR-NK细胞疗法安全有效的重要保障。安全性应该成为药品/医疗技术的“定海神针”，应当与有资质的机构合作，按照严格的标准开展临床前安全性评价和有效性评价。这不仅是对一般患者的负责，也有助于基础科学知识的获得。首先要保证技术准入要求，科研平台拥有细胞疗法的环境以及设备。同时强调机构主体责任，明确开展临床研究的医疗机构承担主体责任，医疗机构主要负责人是本机构临床研究管理的第一责任人。医疗机构为其他机构提供技术支持、研究场所，协助进行志愿者招募的，本机构及参与人员同样承担相应责任。

癌症患者渴望获得有效的治疗药物是人之常情，但科研人员不能因为社会期待就放弃严谨的科学态度。科研者重视保护受试者的利益，并真正做到科学研究的目的服从于保护受试者的权益。在权衡受试者的风险-受益比时，也应考虑对社会群体的利益以及对专业知识的贡献。受试者的风险程度不能大于研究结果对社会群体的利益。CAR-NK细胞疗法目前属于免疫治疗癌症中热门领域，因此，首先要确保科研团队受过专业培训或相关的治疗经验。从事癌症免疫治疗的研究人员和医务人员应具备相应的研究能力或者取得相关专业资格证书。这些能够确保在治疗过程中对紧急情况采取及时和准确的对策。同时，对科研人员和医务人员的伦理道德也应制定严格的审批与准入标准，以减少治疗过程中的不正当利益关联，最大限度地保障患者的生命健康权。最后应该加大处罚力度，对医疗机构违规开展临床研究和转化应用、未按规定开展研究、医师违反规定、其他医务人员违反规定、非医疗机构违规开展临床研究等情形明确处罚措施，包括警告、限期改正、罚款、取消诊疗科目、吊销《医疗机构执业许可证》，开除或辞退，终生不得从事生物医学新技术临床研究等；情节严重的还将追究刑事责任。

3.3 加快CAR-NK细胞疗法监管体系建设

2017年，原国家食品药品监督管理总局发布《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》，对细胞治疗产品按照药品管理相关法规进行研发时的技术要求进行了总体阐述。该指导原则发布以来，我国干细胞治疗产品的研发和注册申报数量明显增加。2019年4月，国家药品监督管理局启动了中国药品监管科学行动计划，首批研究项目包括“细胞和基因治疗产品技术评价与监管体系研究”，该项目将通过发布一系列技术指南，建设与完善细胞和基因治疗产品的技术评价体系。

2020年7月首个技术指南《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则(征求意见稿)》发布，意味着国家对免疫细胞治疗的认可。而进一步规范免疫细胞治疗的临床研究，是期望能得到更加准确和安全的治疗效果。但是，此次出台的征求意见稿还是一个原则性的文件，希望未来会有进一步的细致条文。如对医院制备细胞能力的要求，究竟是要求何种条件，何种培养环境，使用何种实验试剂、耗材等，征求意见稿里并没有具体明确的细则。由于细胞治疗产品的独特特性，如异质性/复杂性、有限的保质期和稳定性、很少或没有用于生产的行业标准或参考材料，以及其作用方式的模糊性，与其他生物制品的《药品生产质量管理规范》(good manufacture practices,GMP)生产相比，其质量更难确定、保证和重现。此外，这些产品很难消除安全风险，因为它们的许多测试方法没有得到验证，或者无法用于细胞治疗产品的适当评估[16]。因此，建立细胞免疫治疗安全性评价体系是保障患者利益的本质要求，安全评估标准应适用于整个治疗过程。

不论是双轨制还是单轨制，最终的目标都应当是用尽可能安全、有效的医疗手段为患者谋福祉。清晰的监管能引导产业有序发展，助推产业释放潜能。加快完善细胞疗法相关制度，可以让企业少走弯路，节约整个行业的资源，促进监管和审批流程更加科学高效。完善我国的监管制度，既需要借鉴先进国家和地区的理论与经验，也要考虑本土现实，这既可以促使细胞治疗领域良性健康发展，也有利于这一新兴疗法真正有益于人类的健康。

3.4 提高伦理委员会对CAR-NK细胞疗法的审查能力

CAR-NK细胞疗法目前尚处于临床研究阶段，其潜在价值和风险仍未完全了解。因此，在进行临床研究之前，对细胞疗法的安全性和有效性进行全面的评估是势在必行的。我国的一些伦理委员会缺乏必要的实践经验和理论知识，伦理委员会在细胞治疗相关问题上的培训体系还不完善[17]，对细胞疗法的基本范畴的了解也比较薄弱。因此，伦理委员会应定期邀请细胞疗法领域权威专家进行培训或者参加国内外的学术交流活动等，提升对CAR-NK细胞疗法的认知能力；建立考核机制，选取具备该领域伦理审查能力的人员，进而提高对CAR-NK细胞疗法伦理审查的专业性；细胞疗法的临床试验往往是多中心试验，有必要建立区域伦理委员会，整合和共享区域资源。从而正确、及时地指导和监督细胞治疗的研究方案、知情同意和试验过程。机构伦理委员会应当了解CAR-NK细胞研究过程，从知情同意、NK细胞分离与制备、回输、患者随访及不良反应监测各个环节予以规范和伦理监管。

4 结语

CAR-NK细胞疗法逐渐成为癌症免疫治疗领域的热点之一，同时也取得了多方面的进展，但是仍然有许多技术短板需要克服。尽管与CAR-T 细胞疗法相比，CAR-NK细胞疗法具有细胞因子风暴发生率低、副作用小的特点，但是仍然需要关注其安全性的问题。对于CAR-NK细胞疗法的临床研究，科研人员应始终秉持严谨的科学态度，尊重生命、敬畏生命，保护患者的健康权。国家管理部门应尽快完善相关法律法规、制定CAR-NK细胞疗法国家标准操作规程，支持该领域的健康发展。伦理审查相关人员应该深入学习CAR-NK细胞疗法的相关知识，全面掌握该领域的法律法规以及技术规范，提升审查能力，确保临床研究在保护受试者权益的前提下规范开展。