杨海平，咸 洋，韩 彪，王 磊，葛 磊，解孝满，李文清

（山东省林草种质资源中心，山东济南250102）

林木种子保存是林业研究的基础性、战略性工作。我国林木种子保存研究发展缓慢，除了树木种类繁多、野外采集困难等基本特征外，一个重要原因在于木本植物产生大量顽拗性种子。据报道，约5%～10%的被子植物种子是顽拗性种子[1]，在热带地区约47%的植物种子为顽拗性种子[2]。顽拗性种子主要是木本植物种子，一般种子体积较大，具有重要的经济价值，这些种子不耐干燥，无法低温保存，是公认的世界性难题，顽拗性种子保存技术是林木种子保存研究的重要方向[3]。目前对林木种子顽拗性特征研究尚未取得突破性进展，种子顽拗性产生机理和脱水伤害机制还没有形成理论体系[4-5]，这是制约林木顽拗性种子保存研究的关键问题。

顽拗性林木种子包括橡胶、木薯、油棕等作物；龙眼、荔枝、芒果等热带水果；咖啡、桂皮、八角等香(饮)料；板栗、榛子、银杏等重要经济林；壳斗科、棕榈科等用材和观赏林[6-7]。鉴于顽拗性种子保存对国民经济发展的重要性，其顽拗性形成机理和保存技术研究显得迫切而重要。林木顽拗性种子为人类提供了许多宝贵的资源，相关研究成果已成为种子研究和科普的重要方向[8-9]。

1 顽拗性种子的概念和分布

1.1 种子顽拗性概念产生

Roberts[10]根据植物种子保存特性将种子划分为顽拗性种子（recalcitrant seeds）和正常性种子（orthodox seeds）。Farrant[11]提出植物种子顽拗性是连续的群体，存在低度、中度、高度等不同类型。Ellis[12]认为顽拗性种子和正常性种子之间还存在中间性种子（intermediate seeds）。设施保存库低温保存正常性种子的理论基础是种子生命力方程，而顽拗性种子的存在则为种子保存行为提出了严峻挑战。研究表明，顽拗性种子具有脱水敏感性，大多数顽拗性种子在成熟脱落时依然保持较高的含水量，这类种子轻度脱水后种子活力显著下降[13]，顽拗性种子无法在低温和低湿的环境下长期保存，因此种子保存库无法保存这类种子，这使得顽拗性种子成为种子保存研究的热点问题[14,15]。

1.2 顽拗性种子种类和分布

顽拗性种子主要是多年生木本植物的种子及少量水生植物的种子。Farnsworth[16]根据文献资料，发现有195 种植物种子属于顽拗性种子，分属78 个科和195 个属；Mayrinck[17]比较了巴西生物多样性热点地区30科79 种植物种子，发现47.4%的物种产生正常性种子，19.2%产生中间性种子，33.3%产生顽拗种子。刘明航[9]根据英国皇家植物园邱园（KEW）种子信息网站公布的种子信息，整理了24781 份种子信息，其中620 种顽拗性种子，149 种中间性种子，23472 种正常性种子，540 种不确定，顽拗性种子和中间性种子约占统计数量的3.1%。产生顽拗性种子的植物多分布于热带，温带的顽拗性种子主要集中在壳斗科和槭树科，大多数科的植物种子保存类型通常包括2 种(顽拗、正常)或3 种(顽拗、中间、正常)类型[18]，因此种子的保存特征和其所属的科属无必然的联系，没有明显的系统分类学特征[19]。Tweddle[20]对不同生境条件下植物种子特性研究，发现温带地区的517 种草本植物种子仅0.2 %的种类不耐脱水，但是886 种木本植物种子有18%的植物种子在干燥后失去活力。处于不同生境的同一物种，其脱水耐受性亦有差别，Chen[21]对西南地区野生茶树（Camellia sinensisL.）脱水耐性的研究表明，不同生境茶树种子脱水耐性存在明显差异。Tweddle[20]对93 科886 种乔（灌）木的种子进行研究表明，在热带及亚热带地区，常绿雨林47%为脱水敏感性物种，而热带沙漠和半沙漠地区仅2%； 在温带地区，湿润的温带森林有23%是顽拗型种子，温带沙漠及半沙漠地区几乎没有顽拗性物种。

2 顽拗性种子特征

2.1 顽拗性种子的基本特征

文彬[14]把种子顽拗性的特征划分为种间、种内和个体发育3 个层面，提出种子顽拗性是一种复合性状，其核心性状包括耐脱水、耐低温及耐保存等方面的内容，顽拗性的伴随性状包括种子大小、千粒重、含水量、休眠特性、分类地位、地理分布和保护性物质含量等多方面的内容。Berjak[22]认为不同植物的种子具有不同程度的顽拗性，顽拗性与正常性不是绝然分开的，而是逐渐过渡的，构成一个种子顽拗性的连续谱，顽拗性种子和正常性种子位于这个连续谱的两端。就单一物种而言，其种子顽拗性特征应该包括脱水敏感性特征、形态结构特征、细胞成分特征和分子生物学特征等方面[8,23]。

2.2 脱水敏感性与临界含水量

种子顽拗性不仅在不同科、属、种之间存在差异，同一物种在不同实验室有时也会得到不同的结论，例如印度苦楝种子曾被划为顽拗性种子、中间性种子和正常性种子[24-25]。茶[26-27]、小粒咖啡[12]、野生稻[28]种子保存特性也有不同的报道。顽拗性种子在不同发育阶段脱水耐性亦存在差异，板栗[29]、蒲葵[30]等顽拗性种子在成熟前存在一个脱水耐性相对较高的阶段，但是总体而言，这些种子在整个发育过程中大部分时间对脱水敏感。由于不同实验室、不同研究人员对种子（胚）脱水处理方法不同，导致脱水耐性存在较大差异，PEG 渗透胁迫、ABA 预培养、脱水速度、梯度蔗糖培养等都可以用来诱导和提高一些顽拗性种子的脱水耐性[31]，因此，建立标准的顽拗性种子脱水技术是未来研究顽拗性种子脱水耐性的重要技术手段。

顽拗性种子特征与含水量具有重要的联系，研究表明，顽拗性种子含水量一般较高，成熟期的含水量分布范围约为36%～90%[32]。林木顽拗性种子脱水临界含水量一般较高，含水量下降时，会导致种子脱水伤害。顽拗性种子内部水分多为自由水，这些自由水维持了细胞旺盛的代谢水平[33]。有些顽拗性林木种子如山红树和望天树，种子含水量很高，本身含水量足以保证萌发，亦无萌发限制因素，种子脱离母株前就可以萌发，而多数顽拗性种子脱落之后，在少量降雨后或湿润生境中可以自由萌发[13,34]。顽拗性种子在成熟时多保持较高含水量，对脱水和低温敏感，是其无法长期保存的重要因素[5,35]。目前，已有一些使用差示扫描量热（DSC）技术分析种子内部水分热力学特征的报道，Hamilton[36]使用DSC 分析了澳大利亚3 种野生植物（C.australasica，C.inodora，C.garrawayi）不同含水量种子热力学特征，Al[37]利用DSC 测定了长叶金柑（Fortunella polyandra）种子的临界含水量。综上所述，使用DSC 等新技术结合种子（胚）萌发率测定，能够对种子脱水敏感性和临界含水量进行鉴定，这将是顽拗性种子研究的重大创新，具有较好的应用前景。

2.3 顽拗性种子形态特征

Cerabolini[38]认为种子脱水耐性及保存寿命与种子形态特征有关。Pritchard[34]通过对南洋杉科和龙脑香科顽拗性种子与正常性种子的比较，发现顽拗性种子表面积与体积比值较小。Daws[6]发现正常性种子的种皮比顽拗性种子的种皮厚，顽拗性种子的种皮在整个种子所占的比重小。同属植物中，顽拗性种子一般大于正常性种子，Gleiser[39]对46 种槭属植物种子研究表明，正常性种子千粒重一般小于顽拗性种子千粒重。Hong[32]对23 种壳斗科植物种子进行分析，发现16 种正常性种子千粒重小于7 种顽拗性种子千粒重。Xia[40]对顽拗性栎属植物种子研究发现，栎属植物果皮形态解剖特征决定了果实水分进出的速率，形态特征对水分的保持具有重要意义。Walters[41]在研究顽拗性种子脱水时发现，脱水过程中细胞难以形成稳定的空间结构，进而影响细胞的功能。Wesley-Smith[42-43]对植物Acer saccharinum低温保存的胚轴超微结构进行观察时认为，细胞在低温条件下的结冰现象是影响种子保存活力的重要影响因素，细胞内冰晶会造成细胞的物理伤害，进而导致细胞自噬降解，并可能引起程序性细胞死亡。韦树根[23]对桑寄生顽拗性种子脱水后形态结构研究时发现，种子脱水过程中细胞器受到损伤，线粒体的形态结构破裂，核仁逐步降解，脂肪体及淀粉粒分解劣变。目前，顽拗性种子形态特征研究多集中在种子整体形态特征或者胚轴细胞透射电镜分析，还缺乏细胞群体层面的观察和测定，因此需要对脱水过程中细胞群体形态变化效应进行分析，从而更加全面的了解顽拗性种子脱水过程中产生的细胞形态变化。

2.4 顽拗性种子分子机制研究

目前，关于顽拗性种子形成的分子机制尚无成熟的理论体系，但是不同的学者从不同的角度进行了研究。顽拗性种子含水量较高，种子脱水过程中其内部活性氧自由基（ROS）的含量逐渐增加，ROS 清除系统的活性与顽拗性产生具有密切联系[44-46]。茶树顽拗性种子减少活性氧自由基可以显著降低种子脱水过程引起的损伤，提高种子萌发率[27]。因此，研究抗氧化系统调节对顽拗性种子形成机制研究具有重要意义。研究显示，正常性种子的脱水耐受性获得与应激防御相关基因的表达上调有关，这些基因包括胚胎后期丰富蛋白（LEA）、抗氧化系统和代谢途径[47]。顽拗性种子在脱水过程中抗氧化系统活力下降和脂质过氧化是种子活力丧失的重要表现[48]，Chen[49]进一步指出，磷脂酶Dα1 介导的细胞膜磷脂酸的变化是脱水诱导种子活力丧失的关键决定因素。袁支红[50]和Sunderlikova[51]分别使用cDNA-AFLP 技术分别对茶树和橡胶顽拗性种子脱水过程中的差异基因进行研究，发现脱水过程中的部分差异基因与拟南芥衰老蛋白有很高的同源性，并发现了一些脱水相关基因。Kalemba[52]对槭属3 种正常性种子和顽拗性种子脱水后的差异蛋白分析，发现了一个小热休克蛋白在脱水过程中高度表达。

刘迪[53]认为种子顽拗性形成与小热激蛋白（HSPs）和胚胎后期丰富蛋白（LEA）具有一定关系。李磊[15]指出正常性种子脱水耐性的获得和保留与LEA 蛋白家族中的D-Ⅱ家族（脱水素）有着密切的关系。正常性种子脱水时，由于LEAs 蛋白的亲水性，在细胞内部结构和大分子周围形成了一层具有保护作用的水态膜，从而使种子具有脱水耐性[54]。Julien[55]在对栗豆树（Castanospermum australe）顽拗性种子的研究中认为LEA 的缺乏可能是造成其脱水敏感性的重要原因，文彬[14]在分析大量研究的基础上，认为LEA 蛋白与脱水敏感性具有紧密联系，但是不能简单的归类为有和无的区别。目前尚无充分证据显示种子顽拗性与缺乏某种蛋白相关，也缺乏顽拗性种子不同含水量梯度下蛋白质数量和质量差异的系统研究，因此需要对顽拗性种子脱水过程中不同含水量种子（胚轴）蛋白质组的变化进行测定，找出关键差异蛋白，并研究关键差异蛋白在脱水过程中的作用，从而为揭示种子顽拗性的分子机制提供理论依据。

3 顽拗性种子保存技术

3.1 低温保存

顽拗性种子短期贮存方法有气调法、吸涨保存法、水浸保存法、部分脱水室温保存法等。这些方法主要是在保持种子活力的前提下，将其保存在所能承受的最低温度下，避免水分丧失，并防止微生物的侵染，可使顽拗性种子的寿命延长至数月，甚至数年[56]，如顽拗性种子Trichilia dregeana在生长期未完成前脱落，能在16℃的最佳保存条件下保存数月，才出现明显的萌发状态[57]，具有休眠特性的顽拗性种子龙眼和三七等可采用层积砂藏保存，在休眠期内为种子提供水分，短期内能够保持种子活力[15]。但是这些短期保存方法因种而异，顽拗性种子由于耐脱水和耐寒程度不同，因此尚无适用所有顽拗性树种的短期保存方法。

3.2 超低温保存

顽拗性种子没有规范性的长期保存方法，目前使用较多的是液氮保存法，在低含水量下，种子能保存在-196℃下不受伤害。由于大部分顽拗性种子个体大，脱落时含水量高，而大粒的林木顽拗性种子难以快速脱水，而缓慢脱水和降温会对种子产生致命伤害，小粒的顽拗性种子已有超低温保存报道，这类种子容易快速脱水，如印度楝（Azadirachta indica）顽拗性种子的超低温保存[58]。对于体型过大的林木顽拗性种子，需切取离体胚轴作为外植体进行超低温保存，Wen[59]和Wen[60]先后对蒲葵（Livistona chinensis）胚轴进行超低温保存条件筛选和超低保存试验，发现超低温保存2年后，胚的活力几乎无改变。韩彪[61]对板栗离体胚轴组织进行进行不同超低温保存方法比较，发现PVS2 溶液可以提高超低温保存后胚轴成活率。近年来林木顽拗性种子超低温保存技术研究关注点集中于如何快速降低种子（胚）含水量、降低脱水过程中的氧化胁迫伤害，以及部分脱水、快速冷冻、后续加温等过程中如何避免种子伤害的问题[62-63]。但是总体而言，顽拗性种子超低温保存还存在许多瓶颈问题，大部分顽拗性种子超低温保存仍然处于探索试验阶段，低温保存后形成植株也相对困难[23,64]，需要针对不同物种，研究适合的脱水条件和超低温保存与恢复条件，而后总结规律，形成一套顽拗性种子超低温保存的技术体系。

4 顽拗性种子研究展望

人类基于生产生活需要，根据保存类型的差别将种子分为顽拗性种子、中间性种子、正常性种子，顽拗性种子与正常性种子是一种连续的存在。未来顽拗性种子的研究方向应该主要包括两个方面，一是种子顽拗性机理研究，这将是一项综合性的研究，涵盖林学、植物学、种子科学、分子生物学等多学科交叉研究。二是保存技术研究，目前顽拗性种子的低温保存和超低温保存关键技术还不是很成熟，虽然有个别物种的成功案例，但是没有可推广应用的技术体系。因此，需要不同研究领域的科学家共同合作，将机理研究和保存技术研究协同攻关，才能真正解决这一问题。