李明 冯军 郝涛波

（1，扎兰屯职业学院 162650；2，内蒙古呼伦贝尔市阿荣旗畜牧工作站 162750；3，内蒙古呼伦贝尔市阿荣旗那吉镇综合行政执法局 162750）

目前，人工授精技术被广泛应用于牛、羊、猪、禽及特种动物繁育中，已显示出其巨大的、无可比拟的优越性，并已成为其他家畜繁殖技术的配套技术。牛冷冻精液的半永久性保存、世界范围内的精液贸易和冷冻精液配种技术的普及，使世界优秀种公牛优质精液的利用突破了受母牛配种时间、国界、种牛寿命的限制。支撑家畜人工授精这项技术背后的是一系列跨学科、跨专业关键设备和技术的推广和应用。精液中精子密度检查方法的发展及演变就是一个很好的例证。

精液中精子密度检查方法主要有估测法、血细胞计数法和光电比色法。

1 估测法和血细胞计数法检查精子密度的方法及弊端

1.1 估测法

估测法是在显微镜下检查精子活力的同时，依据视野中精子间的距离，将精子密度粗略划分为“浓密”“中等”“稀薄”“无”4 个等级。这种方法受人为因素影响大，分级粗略，不能准确量化与评价精子密度。

1.2 血细胞计数法

血细胞计数法是借用医学上检查人体血液中红细胞数和白细胞数的方法进行精子密度检查。只是把人的血液换成了动物精液，把检查对象由血细胞变成精细胞。动物种类不同，精子密度也有较大差异。密度较高的动物精液中精子数相当于人体血液中的红细胞数，密度较低动物精液中的精子数相当于人体血液中的白细胞数。因此，检查密度高的动物的精子密度类似于检查血液中的红细胞数；检查密度低的动物的精子密度类似于检查人体血液中的白细胞数。

用血细胞数法检查精子密度需要了解计数板上计数室的结构与规格，用3%盐水在专用稀释管中进行稀释、滴入计数室、显微镜下计数及原精液精子密度的换算。从上述描述中不难看出，用血细胞计数法检查精子密度，其结果较为准确，但方法原始、操作烦琐、劳动强度大。

2 光电比色法检查精子密度的原理

光电比色仪的研制遵循朗波—比耳（Lawb-Beer）定律，最初被广泛应用于分析化学，用以测定化学物质的浓度，又称分光光度计法[1]。许多化学溶液是有颜色的，溶液颜色与溶液浓度呈正比，颜色越深，浓度越高。因此，可以通过测定溶液颜色深浅来间接测定溶液的浓度。当一束光线照射装有一定颜色溶液时，部分光线将被有色溶液吸收，颜色越浓，光吸收比例越大，透光率越小。这种基于比较溶液颜色深浅测定溶液浓度的分析方法称为比色分析，又称分光光度法。

动物精液同样具有吸收光的特性，精子密度越高，吸收光越大。因此，利用分析化学中的光电比色法也可以测定精液中精子密度。

3 光电比色法在测定精子密度的方法

光电比色法测定精子密度是指利用光电比色仪通过测定已知精子密度的精液的透光率，建立透光率和精子密度的回归方程或标准曲线，再通过测定未知密度精液的透光率，对照标准曲线或查透光率与精子密度对照表而获知被测精液中的精子密度[2]。

3.1 分光光度计使用方法

打开仪器预热20min。用“波长设置”旋钮将波长设置在550nm。取一支比色杯，加入3/4 量的已配制好的精液稀释液作为空白对照液，然后进行“调100%”或“调零”操作。

3.2 采集家畜的精液并取样

利用假阴道法采取种公牛精液作为被测样品。

3.3 测定精子密度

用血细胞计数法准确测定被测样品的精子密度。为了计数准确，将每个样本进行两次检查计数，且相对误差不得超过10%，若误差超过此标准，需要进行第3 次重复计数，取2 个数值相近的结果作为最终结果。

3.4 稀释被检精液

对已知精子密度的原精液用0.9%氯化钠溶液作1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 的稀释。稀释后各浓度的精子密度可换算得知。

3.5 用光电比色法检查不同密度梯度的精液的透光率

经过仪器预热、选定波长、空白液“调零”等操作后，测定出不同密度梯度精液的透光率，记录测定结果。

3.6 建立透光率和精子密度的线性模型，绘制反映透光率和精子密度间关系的标准曲线

在标准坐标纸上以透光率为横坐标，以精子密度为纵坐标建立标准曲线。根据透光率与精子密度的变化规律，对照坐标图中形成的标准曲线的每个点所对应的透光率与精子密度的数值，形成透光率与精子密度对照表[3]。

值得一提的是，在不同型号的光电比色仪显示器上有两组读数，除了显示透光率外还标有光密度，两组数据可通过数学运算进行换算，在生产实践中，测定结果可选择不同的名称（透光率或光密度）去表示。即形成的标准曲线或对照表反映的也可是光密度与精子密度间的对应关系。另外，在建立标准曲线时，透光率（或光密度）与精子密度也可对调坐标，其变化规律和对应的数值关系是一致的。

3.7 透光率（或光密度）与精子密度标准曲线图或对照表的应用及精液中精子密度的测定

建立标准曲线或对照表后，对生产实践中未知精子密度的精液只需用光电比色仪测定出其透光率（或光密度），即可根据透光率（或光密度）与精子密度标准曲线图或对照表，推算出或查出不同透光率（或光密度）下的精子密度。根据经验，在测定精液样品时，将牛的原精液先稀释80～100 倍，再测其透光值效果较好。

比色分析具有简单、快速、灵敏度高等特点，广泛应用于微量组分的测定，通常测定含量在10-1～10-4mg 辕L 的痕量组分。在用比色法检查精子密度时，若在建立标准曲线时能选择20个以上的稀释浓度，利用Eviews 或Excil 软件操作系统进行处理，可得到线性回归方程，将测得的透光率（或光密度）值代入回归方程，即可准确计算出被测精液中精子的密度。如能用计算机进行程序化计算并连接打印系统，其结果的计算、显示和存贮将更为准确、便捷、清晰。