裴鹏正，贠建民，贾琦，赵雨萱，郝琳

甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州730070

软儿梨又名香水梨，隶属蔷薇科（Rosaceae）梨属（PyrusL.）秋子梨系（Pyrus ussuriensisMaxim.）[1]，主要产自黄河沿岸及湟水流域的甘肃、青海、宁夏三省区的一些地区，品质优良且栽培历史悠久[2]。作为一种西北地区特产水果，软儿梨“冻果”解冻后不仅有独特的风味，而且具有丰富的营养价值，含糖、果酸和维生素等多种成分，据《本草纲目》记载，软儿梨具有润肺止咳、凉心消痰、降火、解疮毒、解酒等多种医疗功效，是食疗兼备的佳品[3−4]，深受消费者喜爱。

近年来，随着乡村振兴战略的实施，甘肃、青海产区软儿梨产业稳步发展，种植面积逐年增加，产量大幅上升。传统上，采摘的软儿梨需经一定阶段熟化后冻藏，待皮色变黑，解冻即可食用。而这种“冻果”形式的消费方式，由于受季节、贮藏和流通条件等因素影响，销售受到极大限制，已成为制约产业发展的瓶颈，亟待寻求新的加工途径。

目前，已开发的软儿梨加工产品有梨汁饮料[5]、含片[6]和果酒[7]等。其中，以软儿梨为原料发酵而成的果酒，因果香浓郁、酒香协调而备受消费者青睐。现有软儿梨果酒工艺主要是以皮渣分离后的果汁发酵酿制而成，对果酒的风味、色泽均有一定影响。而关于软儿梨果酒带皮渣发酵工艺及其发酵过程中风味变化方面的研究尚未见报道。风味是评价果酒品质的重要指标，探讨酿造过程中风味变化规律已成为研究的热点。如康明丽等[8]利用GC-MS探究了带渣柑橘果汁酿造果酒前后香气成分变化，发现发酵后香气成分总含量增加，生成19种新的香气成分，其中乙酸乙酯、苯乙醇等18种化合物经发酵后得到保留，带渣柑橘果酒中含量最多的风味物质是酯类，其中辛酸乙酯、正己酸乙酯及癸酸乙酯对柑橘果酒风味有重要贡献。

果酒中的醇类是氨基酸经Ehrlich途径转化，或是糖代谢产生的[9]。醇类物质含量在不同发酵时期均最高，是果酒中的主要香气成分，其散发出诱人的甜香和清香，令人愉悦[10]。醇类物质中，正戊醇和正辛醇在整个发酵阶段含量均较高，可将酯类物质香气凸显出来，使得香气更加协调[11]。酸类物质不仅是酵母代谢的次级产物，还是合成酯的前体物质[12]。酸类物质少量存在时可为果酒带来乳酪和脂肪香味，但过多的酸类物质会对果酒整体香气以及品质造成负面影响[13]。萜烯类化合物花果香浓郁，其感官阈值虽较低，但在果酒中是特征香气的主要贡献者[14]，芳樟醇和4-萜烯醇含量较高，是软儿梨果酒主要的特征香气。其他类物质中酚类物质含量较高，果酒的酚类物质具有抗氧化和抗诱导有机体突变等作用，同时可赋予果酒丰满醇厚、结构感强、后味悠长的特点[15]。

本试验以产自青海省民和县的软儿梨冻果为原料，基于工厂现有的适宜工艺条件，对软儿梨果酒发酵过程中挥发性风味物质进行动态跟踪分析，确定软儿梨果酒中的特征风味物质，明确发酵过程中软儿梨果香的保留情况，并探究后发酵时间的延长对软儿梨果酒品质的影响，旨在为改进软儿梨果酒发酵工艺、调控软儿梨果酒发酵过程中风味形成提供科学理论依据，并为软儿梨“冻果”高附加值利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

软儿梨由青海民和县沿雅梨园文化旅游有限公司提供。

试剂：2-辛醇（色谱级，美国Sigma公司）；商品酿酒酵母红佳酿（意大利Enartis公司）；氯化钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；果胶酶（30 000 U·g−1，山东隆科特酶制剂有限公司）；白砂糖（食用级）。

1.2 仪器与设备

TD5A-WS台式低速离心机，购自东莞康润试验科技有限公司；固相微萃取装置、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅萃取头，购自美国Surpelco公司；TRACE1310-ISQ气相色谱−质谱联用仪，购自法国Salleron公司；ME104E电子天平，购自梅特勒−托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵工艺将软儿梨冻果解冻，去除霉烂果后经机械破碎打浆得到软儿梨果醪，先打入酶解罐中，按照质量分数0.05%的比例加入果胶酶，在35℃下酶解1 h；之后将酶解果醪转入10 T的发酵罐中，添加白砂糖调整糖度至23 Brix°。添加SO2至浓度为0.25 g·L−1，将活化后的红佳酿酵母种子液（活性干酵母融入10倍重量的洁净的温水中后，轻柔地搅动；静置20 min后再次轻轻地搅动）按2.5%（体积分数）的比例加入到果醪中，搅拌使酵母种子均匀分布。将果醪温度调至19±1℃带皮渣发酵14 d后（糖度降至5 Brix°），发酵罐温度降至13℃以下，进行果酒后发酵85 d，酒味馥郁时整个发酵结束。期间定期取样分析醪液中糖度、酒精度及挥发性成分等指标。

1.3.2 样品预处理分别取原汁（0 d）、发酵过程（7、14、28 d）及后发酵（100 d）过程适量发酵醪液进行离心处理（8 000 r·min−1，15 min），取上清液待测，每次取样测定3组平行。

1.3.3 香气物质萃取参照曾朝珍等[9]的方法，并略作修改。取8 mL果酒发酵液加入15 mL顶空瓶中，加入2.50 g氯化钠和90 μL内标物（2-辛醇，81.06 mg·L−1），加入磁力搅拌转子后迅速密封，置于40℃恒温磁力搅拌器中平衡30 min，再顶空萃取30 min。

1.3.4 GC-MS条件色谱条件：DB-WAX色谱柱，不分流进样，载气流速1 mL·min−1，进样口温度240℃，解析时间5 min，升温程序为初温40℃保持5 min，之 后 以3.5℃·min−1升 至220℃保 持15 min。

质谱条件：电子轰击离子源（EI），电子能量70 eV，传输杆温度180℃，离子源温度200℃，质谱扫描范围35～350 m·z−1。

1.3.5 定性和定量分析定性分析：根据GC-MS

得出的软儿梨果酒挥发性香气化合物的质谱信息，与NIST标准谱库对比，并参考相关文献[16−17]的方法进行定性分析。

定量分析：采用内标法进行半定量分析（校正因子为1），计算公式如式（1）。

式中：Xi为待测香气含量；Cs为样品中内标物（2-辛醇）的浓度；As为内标物的峰面积；Ai为待测香气的峰面积。

1.3.6 ROAV分析参照刘登勇[18]的方法并稍做修改，采用ROAV分析法确定软儿梨果酒发酵过程中关键挥发性风味物质。在此之前，采用气味活度值（odoractivityvalue，OAV）方法先确定对样品风味贡献最大的挥发性组分，气味活度值即嗅感物质的绝对浓度（C）与其感觉阈值（T）之间的比值，公式如（2）式所示。

规定对样品风味贡献最大的挥发性香气组分ROAVmax=100，根据（2）式定义，其他挥发性组分ROAV值计算根据公式（3）。

式中：Ci表示不同挥发性组分的相对含量；Cmax表示对样品总体风味贡献最大挥发性组分的相对含量；Ti表示各挥发组分的感觉阈值（μg·L−1）；Tmax表示对样品总体风味贡献最大组分的挥发性组分的感觉阈值（μg·L−1）。对果酒整体风味的贡献越大，各挥发性组分的ROAV值越大。

1.3.7 感官评价香气物质通过人体感官的感觉进行评价，香气成分鉴定时人体感官分析的参与有重要意义[19]。参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]，并参考相关文献[21]制定了软儿梨果酒感官评价标准（表1）。在标准品尝室选择7名专业感官评价成员，组成软儿梨果酒感官评价小组。从色泽、澄清度、香气、滋味和典型性5个方面评价，分数从高到低表示果酒品质从优到差，评价结果使用雷达图进行分析。

表1 软儿梨果酒感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard of Ruan′er pear wine

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010整理试验数据，使用Origin 9.0绘制图表，利用Heatmap软件进行热图分析，使用SPSS 19.0进行差异显著性及主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵阶段挥发性化合物种类及含量变化

果酒的香气主要来自果实本身、酵母发酵及陈酿等过程[22]，香气成分是评价果酒品质特性必不可少的指标。这些挥发性香气成分通过富集作用，共同赋予软儿梨果酒浓郁、独特的风味。软儿梨果酒发酵不同阶段挥发性化合物种类、总离子流图及含量变化分别如图1、表2所示，由图1A可知：软儿梨果酒发酵从开始到结束，醇类和酯类物质在不同发酵时期种类均最多。总体香气化合物种类在不断变化，发酵开始时检测出59种化合物，发酵结束时共检测到60种化合物。由图1B可知：在不同的发酵时期，化合物出峰时间不同，表明化合物保留时间不同，同时在不同的发酵阶段，离子强度（峰高）是不同的，表明挥发性物质在不同发酵时期的含量不同。

图1 各时期酒样中挥发性物质种类和总离子流图Fig.1 Volatile species and total ion flow diagram of wine samples in different periods

由表2可知：整个软儿梨果酒发酵过程中共检出88种挥发性化合物，其中酯类33种、醇类29种、酸类6种、萜烯类7种和13种其他化合物。发酵的不同阶段风味物质的种类和含量是动态变化的：主发酵开始时（0 d）59种，总含量1 937.68 μg·L−1；发酵第7天时（7 d）69种，总含量5 197.31 μg·L−1；发酵第14天（14 d）64种，总含量10 078.94 μg·L−1；发 酵 第28天 时（28 d）69种，总 含 量7 579.84 μg·L−1；后发酵结束时（100 d）60种，总含量8 339 μg·L−1。整个发酵过程中挥发性化合物中有9种消失，新增13种，乙酸乙酯、己酸乙酯、正戊醇和大马士酮等46种化合物得到保留。酯类和醇类物质含量较高，乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、正戊醇、正己醇、正辛醇、1-壬醇构成了软儿梨果酒的主体香味成分。酯类物质中，发酵末期乙酸乙酯含量最高，含量为172.46 μg·L−1[23]。本实验中酸类物质检出较少，其总体含量先增加后减少，未对果酒香气和品质造成负面影响。

表2 各时期酒样中挥发性物质GC-MS检测结果Table 2 GC-MS results of volatile compounds in samples of different periods

续表

续表

2.2 果酒中挥发性风味化合物聚类分析

对挥发性香气化合物进行热图分析，进一步确定不同发酵阶段香气成分的特点，结果如图2所示：对原汁（0 d）、主发酵（7、14、28 d）和后发酵（100 d）3个阶段果酒样品进行聚类分析可知，软儿梨果酒在发酵过程中香气成分呈动态变化。28 d和100 d首先发生聚类，表明在主发酵结束到后发酵的过程中，总体挥发性物质的含量相似度较高。5个时期整体分析表明，乙酸乙酯、己酸乙酯、甲基庚烯酮、辛酸、正己醇、正戊醇、1-壬醇、正癸醇、正己酸、正辛醇颜色较深，说明这几种物质在发酵过程中含量较高。而且，对蓝色区域面积分析表明，在保留原果芳香成分的同时，发酵产生了新的香气物质，共同构成了软儿梨果酒独特的风味。

图2 软儿梨果酒挥发性物质含量热图Fig.2 Heat map of volatile substances in Ruan′er pearwine

研究表明，使用GC-MS检测出的大部分挥发性物质仅少部分能对呈现果酒特征香气做出重要贡献，并赋予果酒独特的香气。因此，挥发性成分种类和含量高低不能准确描述其对风味的贡献度大小，结合ROAV与主成分分析才能进一步判断不同发酵阶段的特征香气成分。

2.3 基于ROAV分析果汁中关键香气变化情况

2.3.1 确定原汁中关键香气成分为进一步确定软儿梨果酒发酵过程中对风味有重要贡献的关键挥发性化合物，采用ROAV法并结合挥发性风味物质的阈值确定原汁中关键香气成分，通过不同

发酵阶段果酒样品的平均值计算ROAV分值，当ROAV评分在0.1~1.0之间时表明对原果汁或发酵果酒的风味有重要修饰作用，评分在1~100则表明该物质是影响风味的关键物质。分析结果如表3所示，软儿梨原汁（0 d）中ROAV评分在1~100之间的物质共8种，分别是丁酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、正辛醇、大马士酮、芳樟醇、丁香酚和癸醛。在整个发酵阶段，醇类物质是软儿梨果酒中含量较高的风味物质，其气味阈值较高，所以ROAV值较小，但其对软儿梨果酒香气的潜在贡献较高。酯类物质含量虽然低于醇类物质，但随着发酵酯类物质的种类和数量均增加，软儿梨果酒果香愈加浓郁。本试验中酸类物质ROAV值较低，对果酒风味起修饰作用。萜烯类物质中大马士酮ROAV值一直较高，可赋予果酒强烈的玫瑰香气，也是软儿梨中的特殊风味物质，对软儿梨果酒独特风味风格的形成有重要影响。其他类物质中丁香酚ROAV值较高，说明对果酒的风味贡献较大。

2.3.2 原果香味在发酵过程中的保留情况为探究原果香味在发酵过程中的保留情况，对软儿梨原汁中关键风味物质在发酵过程中的含量变化情况进行分析，结果如表4所示：随着发酵进行，癸醛含量减少并在后发酵过程中消失，发酵结束时，己酸乙酯（愉快的果香味）、正辛醇（柑橘味）、芳樟醇（花香味）和丁香酚很好的保留并且含量较原汁中增加。大马士酮（玫瑰香）保留率为69%，丁酸乙酯保留率为29%，2-甲基丁酸乙酯保留率仅为3%。其中大马士酮ROAV值最高，可赋予果酒强烈的玫瑰香气，也是软儿梨中的特殊风味物质，对软儿梨果酒独特风格的形成有重要作用。结果表明，在软儿梨果酒发酵过程中保留了大部分原果特征风味物质。

2.4 探究发酵时间的延长对软儿梨果酒风味的影响

对3个不同发酵阶段的果酒挥发性香气成分进行主成分分析，探究发酵时间的延长对软儿梨果酒风味的影响，结果如图3所示，共提取4个主成分，其中前两个主成分的累积方差贡献率为87.64%。

由图3可知，不同发酵阶段的样品在分布图中得到了较好的区分，第0天、第7天分布在两个主成分的负半轴，第14天、第28天主要分布在主成分1的正半轴，第100天分布在主成分2的正半轴。PC1主要反映了3-羟基丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、异丁醇、正戊醇、正辛醇、1-壬醇和苯甲酸乙酯等具有浓郁花果香的酯类和醇类化合物。PC2主要体现了乳酸异戊酯、丁二酸二乙酯、苯甲醇、柠檬烯、乙酸苯乙酯、香茅醇、3-甲硫基丙醇、大马士酮、癸醛等香气类化合物的信息。此外，在香气物质中，PC1与丁酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯呈负相关，PC2与乙酸苯乙酯、丙酸乙酯、3-甲硫基丙醇、大马士酮、香茅醇、癸醛呈负相关。此外，通过分析可知，在主发酵初始阶段，对果酒风味起主要贡献作用的香气物质是丁酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯。发酵第14天、第28天时，贡献香味的主要物质有庚酸乙酯、乙酸乙酯、香茅醇和香叶基丙酮。经后发酵时间的延长，在发酵100 d时，对软儿梨果酒风味起主要贡献的香气化合物主要是乙酸乙酯，酯类物质中乳酸异戊酯、丁二酸二乙酯是新形成的香气化合物，还有α-松油醇、柠檬烯、丁香酚等萜烯类特征风味物质在后发酵过程中含量增加。

表3 软儿梨原汁中关键挥发性风味物质确定Table 3 Determination of key volatile flavor substances of Ruan′er pear juice

2.5 感官评价结果分析

果酒感官品质直接决定了消费者的喜好程度，香气成分的鉴定必须有人体感官分析的参与才更有意义。感官评价结果（图4）表明，发酵初期，香气、滋味为软儿梨原果风味，色泽、澄清度与典型性评分均较低。随着发酵进行，澄清度提高，色泽逐渐变得透亮。发酵末期，软儿梨果酒酒香浓郁，酒体澄清透亮呈金黄色，兼有幽香清雅的果香和酒香，具有软儿梨果酒的典型性。

表4 软儿梨原汁中关键风味物质在发酵过程中的含量变化Table 4 Content changes of key flavor compounds in Ruan′er pear juice during fermentation

表5 主成分特征值及方差贡献率Table 5 Principal component eigenvalues and variance contribution rates

图3 前2个主成分上香气成分的载荷以及供试酒样的分布图Fig.3 The load of aroma components on the first two principal components and the distribution map of the tested wine samples

3 讨论

果酒中含有丰富的营养物质，如维生素、微量元素、矿物质等[24]，目前国内果酒大多数主要以当地特色水果为原料进行加工[25]，梨作为我国主要种植和进行深加工的水果品种[26]，西北软儿梨是极具地域特色的代表之一。研究表明，水果的香气反映不同水果的特性，并直接影响新鲜水果和加工过的水果产品的感官品质[27]。本试验采用SPME-GC-MS技术对软儿梨果酒发酵过程中的挥发性风味物质进行跟踪检测，共检出88种挥发性化合物，包括33种酯类、29种醇类、6种酸类、7种萜烯类以及13种其他类化合物，整个发酵过程中风味物质的总含量先上升后略有下降。ROAV结果表明：发酵结束时，己酸乙酯（愉快的果香味）、正辛醇（柑橘味）、芳樟醇（花香味）和丁香酚得到很好的保留并且含量较原汁中增加。大马士酮（玫瑰香）保留率为69%，丁酸乙酯保留率为29%，2-甲基丁酸乙酯保留率仅为3%。其中大马士酮ROAV值最高，可赋予果酒强烈的玫瑰香气，也是软儿梨中的特殊风味物质，对软儿梨果酒独特风格的形成有重要作用。PCA分析表明：发酵初期主要的香味贡献物质是具有水果香味的丁酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯，随着发酵时间的延长，发酵100 d时的主要香味贡献物质有乙酸乙酯、α-松油醇、柠檬烯和芳樟醇。感官评分表明，果酒风味随着发酵逐渐变好，发酵结束时果酒香气浓郁。

图4 不同发酵时期软儿梨果酒感官评价Fig.4 Sensory evaluation of Ruan′er pear wine in different periods

研究挥发性风味物质具有数量意义和质量意义，分别表示原料的芳香程度和品种纯正性[28]，本研究以青海民和软儿梨为原料进行果酒发酵，并测定发酵过程中的香气成分变化，而在整个发酵过程中，及时监测芳香化合物的类型和数量的变化，对调控酿酒过程中风味形成具有重要意义[29]。果酒香气主要来源于水果自身保留的香气成分和酿造过程中新产生的芳香物质组成[30]。有研究表明[31]水果的香气成分以挥发性的酯类、萜类物质为主，这些物质含量少并且在发酵时易损失，在原果酒中很难检测出来。本研究结果表明，发酵末期的酯类物质总含量比发酵初期多，其中乙酸乙酯含量最高，可能是发酵产生的新的代谢酯香气成分多的原因。有研究表明果酒中乙酸乙酯的含量超过150 mg·L−1会使人感觉不愉快[32]，但在本研究中，其含量远低于该值，所以不会对果酒造成负面的影响。高级醇是酿酒过程中酵母通过糖代谢途径或者氨基酸代谢途径合成的[33−34]，软儿梨果酒中的高级醇包括异丁醇、正戊醇等成分，其在发酵过程中持续时间长而且有后劲，对果酒的风味起到重要作用。酸类物质是酵母代谢的次级产物，其中含量最高的是正己酸（奶酪、酸臭、水果香）和辛酸（奶酪味、腐败味、涩味），在发酵第14天时酸类物质含量最高，说明发酵14 d时为酵母代谢旺盛时期。萜烯类物质阈值低，在软儿梨果酒中含量较低但香气明显，对果酒整体的香气构成具有重要意义。芳樟醇、4-萜烯醇和α-松油醇是软儿梨果酒中主要的萜烯类物质。有研究表明萜烯类香气化合物由微生物合成，但关于酿酒酵母发酵生成萜烯类物质还未见报道[35]。其他类物质主要是羰基化合物醛类和酮类，其中大部分由微生物活动产生的[36]。本研究共检测出88种挥发性香气化合物，但果酒中的香气成分应远不止于此，还存在不稳定的香气物质，在检测分析时结构易发生变化，对香气的定性定量检测造成很大的困难[37−38]。

软儿梨果酒中香气物质的数量、种类、感觉阈值及各成分间的相互作用共同决定香气的感官特征。本研究分析确定了软儿梨果酒关键香气成分，为软儿梨果酒感官评价体系的构建提供了科学依据。目前，国内外对果酒中特征风味物质的研究取得了显著成果，但在研究过程中发现软儿梨果酒中仍有少部分香气成分未被定性。这些挥发性香气物质的呈味特征及香气阈值还未被确定，因此难以确定其对软儿梨果酒香气的影响，给软儿梨果酒的风味研究造成很多困难。所以在今后的软儿梨果酒研究中，有必要借鉴国内外对葡萄酒、果酒等香气的分析方法对软儿梨果酒的关键香气成分以及形成机理进行研究，以期更好的调控软儿梨发酵果酒风味形成，生产出品质更优良、风味更独特的软儿梨果酒。