王素文 王炯 李锋

1安徽医科大学第一附属医院老年呼吸科,合肥230022;2上海市胸科医院 上海交通大学附属胸科医院呼吸与危重医学科200030

COPD是一种慢性炎症性气道疾病,以呼出气流受限为特征,具有高发病率和高病死率。吸烟是COPD最重要的危险因素,其他的危险因素包括空气污染、生物燃料、社会经济状况、基因遗传等。目前我国约有1亿COPD患者,约占全世界病例总数的25%[1]。当前,COPD的治疗方法主要是对症治疗,缺乏有效的根本性治疗措施[2]。线粒体是细胞内具有双层膜结构的细胞器,其功能包括合成能量即三磷酸腺苷、产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),以及调控钙信号转导、程序性细胞死亡等。线粒体功能障碍影响气道收缩、基因表达、氧化应激、细胞增殖、凋亡和代谢,以及免疫和炎症反应,这些都与气道疾病的发病机制有关[3]。线粒体质量系统包括线粒体生成、线粒体动力学(融合/分裂)、线粒体自噬等。越来越多的研究表明,线粒体质量控制与COPD的发生、发展密切相关。本文针对线粒体质量控制在COPD发病机制中的作用以及相关治疗靶点在COPD治疗中的作用进行概述。

1 线粒体质量控制体系

上世纪70年代Jaime Miquel提出线粒体衰老理论,人们开始认识到线粒体是机体衰老的最重要的细胞器,因为线粒体既是细胞内自由基的靶标又是自由基的来源[4]。线粒体稳态(指数量、质量和功能等的稳态)的维持依赖于线粒体质量控制系统。线粒体生成(或称线粒体生物发生)是指新的线粒体的产生,主要是受过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)控制的高度调控的细胞过程[5]。同时,线粒体是一个动态细胞器,通过不断的融合/分裂来改变其形状。当线粒体受到刺激时,线粒体可以通过诸如线粒体融合蛋白(mitofusin 1/2,MFN1/2)和视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)等线粒体融合蛋白进行融合(通过与其他线粒体结合而扩大),或者通过诸如发动蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)、线粒体分离蛋白1(fission1,FIS1)、线粒体分离因子(mitochondrial fission factor,MFF)等线粒体分裂蛋白进行分裂,即线粒体一分为二。另外,线粒体还通过线粒体自噬在溶酶体中选择性地降解受损的线粒体[6]。如果外界应激刺激严重且持续时间较长,或者线粒体质量控制系统失调,那么,这些适应性反应会失去作用,影响线粒体的稳态,进而影响细胞命运[7]。

1.1 线粒体生成 在线粒体生成过程中最主要调节蛋白是PGC-1α,其表达和活性受到多种途径进行调节,包括酪氨酸激酶受体、G蛋白耦联受体、利钠肽受体和一氧化氮合酶,这些途径均通过环磷酸鸟苷、AMP激活的蛋白激酶的激活和沉默信息调节因子2配对型同源酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,sirtuin1,SIRT1)

介导的脱乙酰作用[6]。核呼吸因子1(nuclar respiratory factor-1,NRF1)和NRF2可调节由核基因组编码的电子转移链亚基的表达,并可与线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)转录有关基因的启动子进行结合。其中,NRF1调节线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)的表达,NRF2调节线粒体酶表达,如线粒体外膜转位酶。当线粒体生成时,PGC-1α活化,导致线粒体NRF1的激活以及随后TFAM合成的增加,mtDNA复制增加,线粒体数量增加。近年来,关于NRF2/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)信号转导在调节线粒体生成的相关研究日益增多。NRF2定位于细胞质,在无活化时与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1结合并被26S蛋白酶体降解。在受到ROS尤其是过氧化氢的刺激时,NRF2被激活,随即与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1解离,游离的NRF2易位至细胞核,与小蛋白Maf形成异源二聚体,随之与ARE结合,或者激活NRF1,进而激活TFAM,介导mtDNA复制[8]。

1.2 线粒体动力学 线粒体融合借助于动力蛋白超家族的三磷酸鸟苷水解酶,即MFN1/2和OPA1,前者促进线粒体外膜融合,后者促进线粒体内膜的融合。近期有研究表明,线粒体磷脂酶D和米托菲林也具有促线粒体融合的活性[9]。当线粒体融合蛋白缺失时,线粒体呈片段化[10]。线粒体分裂由DRP1、FIS1、MFF等蛋白介导。其中,DRP1属于三磷酸鸟苷水解酶,DRP1通过磷酸化、泛素化和S-亚硝基化进行翻译后调控。蛋白激酶C同工型δ在DRP1的Ser616位点的磷酸化具有激活DRP1的功能,而蛋白激酶A在DRP1的Ser637位点的磷酸化具有抑制DRP1的功能[11]。DRP1从胞质转移到线粒体是线粒体分裂的关键,DRP1缺失导致线粒体呈过度融合状[7]。DRP1活化后在靶点部位形成螺旋式多聚物,在内质网、肌动蛋白丝协同作用下,将线粒体一分为二[12-13]。在轻度刺激下,线粒体通过融合而整合部分受损的线粒体,以维持线粒体DNA完整、维持能量代谢;在剧烈刺激下,线粒体通过分裂将受损的线粒体经后续的线粒体自噬过程给予清除。

1.3 线粒体自噬 线粒体自噬是一种高度保守的机制,可以选择性地将线粒体在溶酶体内进行降解,在线粒体质量控制中占有重要作用。已知的线粒体自噬有两种机制:一种是PTEN诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)-Parkin介导的线粒体自噬,另一种是受体介导的线粒体自噬。PINK1是位于线粒体的丝氨酸/苏氨酸激酶,Parkin是一种E3泛素连接酶,由PARK2基因编码,位于细胞质中。正常情况下,PINK1会被线粒体蛋白酶早老素相关菱形样蛋白处理并降解。线粒体外膜转位酶7和PGAM家族成员5,可使线粒体外膜上PINK1蛋白免受降解[14]。在应激状态下,线粒体膜去极化导致PINK1在线粒体外膜上稳定,将胞质中Parkin募集到线粒体介导线粒体自噬。Parkin介导线粒体底物的泛素化,包括MFNs、B淋巴细胞瘤2和电压依赖性阴离子通道,而平台蛋白如sequestosome 1(SQSTM1/p62)等介导泛素化的线粒体底物与微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)相结合从而形成自噬体,最终被自噬溶酶体吞噬、降解[15]。在哺乳动物中LC3-Ⅰ(未结合的胞质形式)到LC3-Ⅱ(自噬体膜相关的磷脂酰乙醇胺结合形式)的转化是自噬体形成的标志[16]。位于线粒体外膜上的蛋白质包括Nix和FUN14区包含1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)是介导线粒体自噬的受体,直接与LC3结合,将受损的线粒体形成自噬体进而降解。其中,Nix是B淋巴细胞瘤2家族蛋白仅有的BH3结构域子家族的成员,参与线粒体自噬和细胞死亡。Nix参与程序化的线粒体清除,以确保红细胞成熟期间的线粒体质量。也有报道称依赖Nix的线粒体自噬对于视网膜神经节细胞和促炎性巨噬细胞的分化至关重要[17]。

2 线粒体质量控制体系与COPD的发生

线粒体质量控制是复杂精细的过程,在线粒体生成、线粒体分裂/融合、线粒体自噬任何过程中出现异常均会导致COPD的发生、发展。

2.1 线粒体生成与COPD 与对照组相比,COPD患者的成纤维细胞非衰老表型中NRF1和PGC-1α的m RNA表达明显升高,而在衰老表型中这种差异并不明显[18]。与健康对照组相比,终末期COPD患者PGC-1α的m RNA水平下降,TNF-α升高[19]。与健康吸烟者组和健康无吸烟者组相比,COPD患者外周血白细胞mtDNA显著减少[20]。在COPD患者随访中,肺功能逐渐下降,NRF2的表达与肺功能呈正相关,对照组在随访过程中NRF2水平无明显变化[21]。可见,COPD患者的线粒体生成存在不同的研究结果。在一定程度的损伤时,线粒体生成适应性增加以缓解细胞损伤程度,而在长时间或严重损伤时,线粒体生成下降。

2.2 线粒体动力学与COPD 低浓度的烟草提取物(cigarette smoke extract,CSE)介导小鼠肺上皮细胞、小鼠肺泡上皮细胞出现线粒体延长、过度融合,MFN2蛋白表达增加,线粒体活性增加[22]。与对照组相比,COPD患者的原代支气管上皮细胞的线粒体肿胀,且呈片段化。有研究表明,DRP1敲低可抑制CSE暴露的平滑肌细胞中线粒体ROS的产生,而MFN2敲低可促进线粒体ROS水平升高[23]。敲除线粒体融合蛋白MFN1、MFN2、OPA1,导致线粒体片段化、细胞衰老增加。线粒体抗氧化剂Mito-TEMPO减少线粒体碎片化和细胞衰老[24]。当CSE与气道上皮细胞长期(3个月)共培养时,低浓度CSE介导Beas-2B细胞的线粒体延长、融合,高浓度CSE引起线粒体片段化,OPA1 m RNA表达增加,线粒体OXPHOS能力增加[25]。低浓度CSE与原代肺上皮细胞(SAEC、NHBE)共培养时,诱导DRP1表达增加,MFN2表达降低[26]。本课题组既往利用10%CSE与气道上皮细胞共培养建立气道上皮细胞损伤模型,我们发现,CSE暴露增加DRP1、MFF的蛋白表达,同时降低OPA1和MFN2的蛋白表达[27]。这一研究结果与他人的研究结果相类似[28]。采用反复、间断臭氧暴露6周(浓度2.5 ppm,3 h/次,每周2次)建立小鼠COPD模型,结果发现,臭氧暴露小鼠的肺组织内DRP1和MFF的蛋白表达增加,OPA1和MFN2的蛋白表达降低[29]。可见,气道上皮细胞的线粒体动力学(融合/分裂)失平衡在COPD的发病过程中具有一定的作用。

2.3 线粒体自噬与COPD 当CSE与肺成纤维细胞、小气道上皮细胞共培养时,CSE介导线粒体自噬受损,Parkin转位到受损的线粒体降低,导致受损的线粒体增多,线粒体ROS增加,细胞衰老[30]。CSE可诱导人支气管上皮细胞的ROS生成增多,细胞衰老,线粒体自噬增多,敲低PARK2基因,会导致线粒体ROS增多,细胞衰老加重。同时,COPD患者的肺组织内PARK2下降且与肺功能下降有关,这说明,PARK2介导的线粒体自噬不足在COPD的发病过程中具有重要的作用。增强或恢复PARK2介导的线粒体自噬可以延缓衰老,抑制COPD的发生、发展[15,31]。相反的是,也有研究认为,CSE诱导气道上皮细胞的DRP1发生磷酸化,同时PINK1蛋白表达增加。COPD患者肺组织的DRP1、PINK1表达增加。PINK1-/-小鼠在受到烟草暴露时,不出现肺气肿及线粒体功能异常。这说明,PINK1介导的线粒体自噬是有害的[32]。烟草暴露小鼠模型中LC3B或PINK1基因缺陷可降低上皮细胞凋亡及坏死,减轻肺气肿及气道功能障碍[33]。除了经典的PINK1/PARK2途径之外,其他途径如Nix/BINP3L也参与CSE诱导的气道上皮损伤[34]。在COPD患者中,Nix/BINP3L表达水平随着疾病严重程度的增加而增加[35]。FUNDC1在CSE刺激的Beas2b细胞中表达增加,敲除FUNDC1基因,肺上皮细胞中炎症减弱,COPD模型小鼠的肺功能也得到改善[36]。这些不同的研究结果可能与不同的细胞类型、缺乏理想的线粒体自噬增强剂/抑制剂等有关。同时,这些研究结果也表明,线粒体自噬可能是一把双刃剑,可能处于动态调控,在COPD的不同发病阶段具有不同的作用。

3 调控线粒体质量控制体系与COPD的治疗

3.1 调控线粒体生成与COPD的治疗 氨茶碱是COPD的常用治疗药物,在人肺支气管上皮细胞中给予氨茶碱可增加线粒体呼吸速率和三磷酸腺苷的产生,同时可增加PGC-1α、NRF1和TFAM的表达水平[37]。白藜芦醇是多酚类抗氧化素的一种,主要存在于葡萄、莓果、花生等果实中,是植物分泌的抗病毒素,具有抗氧化和抗炎特性。白藜芦醇可通过多种途径发挥其作用,最主要的是可直接激活SIRT1,或通过AMP激活的蛋白激酶间接激活SIRT1,SIRT1可以激活PGC-1α促进线粒体生成,其次,白藜芦醇通过调节NRF2发挥抗氧化作用[38]。当白藜芦醇应用于COPD大鼠模型时,小气道炎症和气道重塑减弱,炎症因子IL-6和IL-8下降,超氧化物歧化酶增高,同时,大鼠肺组织中SIRT1和PGC-1α升高[39]。另一种抗氧化剂姜黄素应用于COPD小鼠模型时,气道炎症、肺气肿症状缓解,骨骼肌细胞中线粒体损伤缓解,炎症因子IL-6和TNF-α下降,PGC-1α和SIRT3的m RNA和蛋白水平上调[40]。在细胞模型中,新型复合抗氧化药物(React-On)作用于CSE诱导的人支气管上皮细胞,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平下降,PGC-1α水平增高[41]。以上研究表明抗氧化型药物无论是在体外还是体内实验在COPD模型中都提高线粒体生成,以及恢复肺功能减轻气道炎症。此外,ZLN005,一种新型的选择性PGC-1α转录调节物,可保护视网膜色素上皮细胞免受氧化应激损伤,可使PGC-1α以及相关的转录因子、抗氧化酶和线粒体基因上调,提高线粒体功能和细胞活性。而在PGC-1α沉默时,ZLN005对细胞的保护作用消失[42]。ZLN005对细胞的保护作用对COPD的治疗提供新思路。

3.2 调控线粒体动力学与COPD的治疗 Mdivi-1是DRP1最常用的抑制剂,可降低炎症因子水平,提高细胞活力[43]。在CSE诱导的Beas2b细胞损伤模型中,Mdivi-1抑制线粒体碎片化、提高线粒体膜电位、抑制线粒体自噬,而且,Mdivi-1可以在一定程度上保护烟草暴露诱导的小鼠气道上皮黏膜清除功能障碍[31]。肺上皮细胞组织蛋白酶E(Cat E)过度表达的小鼠(iCat E Tg+小鼠)自发产生肺气肿,Drp-1表达增加,而应用Drp-1抑制剂Mdivi-1可以抑制肺气肿的形成[44]。如前所述,胞质DRP1需要配体MFF和FIS1才能发挥线粒体分裂的作用,新型的选择性肽抑制剂P110可通过此过程抑制线粒体分裂,降低DRP1酶的活性,并能够阻止DRP1/FIS1在神经元中的相互作用[45]。

3.3 调控线粒体自噬与COPD的治疗 抗氧化物槲皮素可抑制CSE诱导的Beas2b细胞pDRP-1和PINK1表达,抑制线粒体功能障碍和线粒体自噬,抑制细胞凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达[28]。新型COPD治疗药物罗氟司特是磷酸二酯酶4抑制剂,通过抑制CSE诱导的Beas2b细胞p-DRP1和PINK1的表达水平以抑制线粒体功能障碍和线粒体自噬,提高细胞活力。

综上所述,线粒体质量控制体系参与COPD的病理生理过程,如气道炎症、氧化应激、肺功能损伤等。越来越多的研究揭示出线粒体质量控制体系在COPD发病机制中的重要作用。研究表明,现有的COPD治疗药物有一定的促进线粒体生成、维持线粒体动力学平衡、调控线粒体自噬,从而维持线粒体稳态。一些调控线粒体质量控制的靶点药物在体外和体内实验均表现出一定的抗炎、抗氧化作用,这为COPD的预防、治疗提供了新的思路与靶点。考虑到肺部众多的结构细胞和炎症细胞,生物学特性差异巨大,在COPD病理生理过程中的作用迥异。因此,需要首先确定特异性的靶向细胞类型(目前研究最多的是气道上皮细胞),再针对性地采用靶点药物调控线粒体质量控制系统才能更好地发挥作用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突