施丹飞，崔戈，李勇

湖州师范学院附属第一医院 病理科，浙江 湖州 313000

血性胸腔积液是恶性肿瘤晚期累及胸膜常见的临床并发症，其主要的临床症状有呼吸困难、胸痛、咳嗽等，这些症状不但降低患者生活质量，甚至会威胁患者的生命[1-2]。收集、寻找血性胸腔积液中的肿瘤细胞，必要时行免疫组化进行进一步诊断和鉴别诊断，可为患者的临床治疗提供依据。近年来，细胞蜡块联合免疫组化的方法由于操作简单、检出率较高被广泛应用于胸腔积液检查中[3-4]。但是传统细胞蜡块制片中大量红细胞常影响苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining, HE染色）制片及免疫组化制片结果。为此本研究通过改良血性胸腔积液细胞蜡块的制作方法，提高细胞蜡块的制片优良率。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集湖州师范学院附属第一医院病理科2018年1月至2021年1月的55例临床送检的疑似恶性肿瘤的血性胸腔积液标本，其中男39例，女16例，年龄28～87（63.4±13.5）岁，55例标本全部进行HE染色和免疫组织化学染色。

1.2 主要设备和试剂 低速离心机（上海安亭科学仪器厂，TDL-80-2B）、脱水机（德国LEICA公司，ASP-300S）、包埋机（德国LEICA公司，Arcadia）、切片机（德国LEICA公司，RM2245）、电热恒温箱（上海精宏实验设备有限公司，DHG-9123A）、染片机（德国LEICA公司，AUTOSTAINERXL）、显微镜（德国LEICA公司，DM2000），抗体购自福州迈新公司，采用KIT-5230试剂盒及DAB显色系统显色。

1.3 方法 每例患者均取4支容积为50 mL的试管，标记为A1、A2、A3和B管，A1、A2、A3管用于传统细胞蜡块制片（传统组），B管用于改良细胞蜡块制片（改良组）。具体操作如下：A1、A2、A3管分别采集胸腔积液15 mL，B管采集胸腔积液45 mL。4管胸腔积液皆以2 500 r/min离心10 min，用吸管吸干上清液。A1、A2、A3管采用传统细胞蜡块制作法，三管沉淀物富集于A1管中。步骤如下：①加入10%中性甲醛液混匀后固定10 min；②以2 500 r/min离心5 min，倒去固定液；③加入75%乙醇混匀，以 2 500 r/min离心5 min，倒掉75%乙醇；④轻轻加入95%的乙醇静置30 min。B管采用改良细胞蜡块制作法，首先添加5%的乙醇乙酸液（即95 mL 25%的乙醇加5 mL冰乙酸），混匀后静置10 min用以破坏红细胞，然后以2 500 r/min离心5 min，吸干上清液，留下沉淀，后续操作同传统离心法（步骤①至④）。后续经常规脱水、包埋、切片、HE染色及免疫组化染色。每例患者的胸水均制成2个蜡块，共收集55例患者的胸水细胞蜡块。

1.4 结果判读 请同一位诊断医师进行阅片，以组织活检的HE及免疫组化染色结果为金标准，依据HE和免疫组化质控的指标对制片质量进行评判。HE制片优良指标为：无破碎刀痕，无厚薄不均，染色清晰、核质分明（细胞核呈紫蓝色，细胞质呈红色），染色对比好；免疫组化Ki-67制片优良指标为：无掉片，无非特异性染色，染色定位好（细胞核呈棕黑色，细胞质、细胞膜无染色）。符合上述要求的组织切片判断为优良，不符合者均纳入不良制片数，统计制片优良率和制片不良率。制片优良率=（优良制片数/制片总数）×100%。制片不良率=（不良制片数/制片总数）×100%。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS22.0进行统计学分析，计数资料以例（%）表示，2组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种细胞蜡块制作方法的HE制片和免疫组化制片不良率比较 改良组的不良制片率显著小于传统组（χ2=8.419，P=0.004）。改良组的HE制片优良率（94.6%）高于传统组（74.5%）。改良组的不良制片率显著小于传统组（χ2=5.636，P=0.018）。改良组的HE制片优良率（92.7%）高于传统组（76.4%）。见表1和表2。

表1 两种细胞蜡块制作方法的HE制片不良率的比较[每组n= 55，例（%）]

表2 两种细胞蜡块制作方法的免疫组化制片不良率的比较[每组n=55，例（%）]

2.2 两种细胞蜡块制作方法的HE染色及免疫组化染色结果比较 传统制作法由于红细胞量多，导致HE染色切片厚薄不均，开裂掉片，整个视野充满了红细胞，肿瘤细胞分散不富集，免疫组化染色切片有非特异性染色，背景呈广泛黄色；而改良制作法由于用乙醇乙酸液破坏了大部分红细胞，HE染色切片没有掉片，染色对比好，肿瘤细胞富集，免疫组化染色切片背景清晰。见图1、图2。

图1 胸水细胞蜡块传统制作法（×100）

图2 胸水细胞蜡块改良制作法（×100）

3 讨论

有些肿瘤晚期患者肿瘤范围过大，有些高龄患者做手术有风险，皆不具备手术指征，此时胸腔积液细胞蜡块病理诊断对于患者的病情评估具有重要意义。胸腔积液中原有的细胞呈分离状，有时仅依靠涂片不能准确辨别出良恶性，在涂片质量差、较少的细胞量以及变形、细胞重叠等因素影响下，难以对患者的疾病性质作出正确的判断，造成误诊率增加，细胞蜡块技术可弥补这一缺点[5]。细胞蜡块制作方法简单，在基层病理科均可开展。而且细胞蜡块可以永久保存，重复多次制片，多项研究表明细胞蜡块可以进行免疫组织化学、分子检测、原位杂交等，可对疾病进行深入研究[6-7]。常见的细胞蜡块结合免疫组化的方法对于肿瘤的分型具有重要的作用，但是血性胸腔积液由于大量的红细胞的存在，影响细胞蜡块的切片质量，给后续的HE染色及免疫组化染色增加了难度。对于免疫组化染色，富含大量红细胞的细胞蜡块经脱水后会质地变硬，切成片经高温修复后容易掉片，导致报告发布时间延迟；其次红细胞中的类内源性过氧化物酶会使组织产生非特异性染色，导致免疫背景加深，影响定位的准确性，继而影响诊断临床医师的判断，最后影响诊断结果。采用改良法则能较好地去除红细胞的影响，保证诊断结果的可靠性，且不易掉片，保证诊断报告发布的及时性。

在本研究中，采用改良法对55例渗出性胸腔积液样本进行细胞蜡块的制片，其优良率（HE：94.6%，免疫组化：92.7%）显著高于传统法（HE：74.5%，免疫组化：76.4%）。原理是乙醇乙酸液作用于红细胞，使其快速膨胀裂解，裂解物可随上清液被弃去，而间皮细胞，肿瘤细胞、淋巴细胞等结构完整、不变形，核质分明，核仁清晰[8]，从而提高了肿瘤细胞的检出率，使用红细胞破坏法制成的切片经HE染色后背景清晰、红蓝分明；经免疫组化染色后无非特异性染色、几乎无掉片，对细胞学诊断具有较高的实用价值。总结本研究中的几点注意事项：①选用容积为50 mL的试管，能聚集更多的细胞；②添加乙醇乙酸液的量以溶液略变浅红色为宜，添加过多易引起细胞退变，添加过少则对红细胞破坏不足；③在血性胸腔积液中添加乙醇乙酸液后，使用震荡器震荡能使两者充分混匀，更利于红细胞的去除。

综上所述，血性胸腔积液使用改良法制作的细胞蜡块，HE和免疫组化制片质量好，对细胞学诊断的价值高，因此更具应用价值。另外，该方法操作简便，试剂易配制，结果较稳定。