任杰 林榕榕 王燕 梁静萍 黎经田 李可贵陈冠铭 李宏杨 刘扬

(1三亚市南繁科学技术研究院 海南三亚 572000;2海南玫瑰谷产业发展有限公司 海南三亚 572000;3三亚市热带农业科学院 海南三亚 572000;4海南热带海洋学院 海南三亚 572000)

月季（Rosa chinensis）是蔷薇科蔷薇属的一种常绿或半常绿灌木，颜色多样，有浓郁的香味，形态各有特点，受到国内外人的喜爱。月季在中国已有2 000年的栽培历史［1］。据统计，现代月季品种约有24 000种［2］，杏花村属于现代月季品种之一的丰花月季（Floribunda Roses），又称聚花月季，1935年Drior用Kirsten Penlsen×Unamed seedling作为亲本育出。其适应能力强，长势好，易管理，花开艳丽，常用于园林绿植。海南三亚的亚龙湾国际玫瑰谷与三亚市南繁科学技术研究院合作，对杏花村引种栽培，发现其适合三亚的气候环境，但因三亚夏季高温高湿天气影响，常规的扦插、压条、嫁接等繁殖方式成活率低、病毒积累严重。阻碍其推广示范，育苗难问题亟待解决。

早在1980年，Hasegawa［3］就在MS培养基上成功培育出攀援月季Improvedfire，证明组培月季可行。组培外植体的选择通常为生长健壮、芽点饱满的枝条，少数也采用叶片［4-7］、叶柄［4，8］、叶盘［8］做外植体。在李海燕等［9］研究中，中部茎段腋芽效果最好，平均萌发时间比顶部和基部芽短6～8 d。其次是基部，再是顶部［9-13］。

适宜浓度的植物生长调节剂能有效促进月季腋芽的诱导。Rout等［14］进行腋芽诱导时，发现6-BA的正常有效浓度为0.5～3.0 mg/L。Bressan［10］在研究Gold Glow时，发现当6-BA量超过0.3 mg/L会对侧芽萌发起到明显的抑制，且NAA的有效浓度为 0.01～0.5 mg/L［15-16］。钱蕾［17］在对粉-A 初代培养研究中，添加6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.05 mg/L，诱导率为94.61%。莫磊兴等［18］研究结果表明，高温会影响芽的萌发，26℃左右最适芽的萌发。

在腋芽的增殖研究中发现，0.1～3.0 mg/L为6-BA的正常有效浓度，0.3 mg/L为IBA的最优有效浓度，0.005～0.500 mg/L为NAA的合理有效浓度［19］。6-BA低浓度最适于促进腋芽的增殖，高浓度则会抑制腋芽生长发育。NAA的浓度高低会影响芽增殖速度，NAA浓度在0.1 mg/L以上时，腋芽增殖率会明显降低［20］。其次，腋芽的增殖还会受环境因子、糖浓度、pH等多项因子的影响。莫磊兴等［18］研究发现，随着光照强度的提高，玻璃化的现象慢慢减缓，光照在3 000 lx左右腋芽的增殖培养率会得到有效提高。培养基的糖浓度与pH高低影响继代的生长周期，因此，月季培养基中的糖含量不得超过50 g/L，pH必须低于5.5。

生根培养通常采用1/2 MS培养基。Hyndman等［21］认为，MS培养基中的氮盐比与无机盐相同，但高浓度氮盐对生根有抑制作用，生根主要利用NAA、IBA、IAA等生长素，且NAA常用有效浓度为0.01～1.00 mg/L，IBA有效浓度为0.01～1.00mg/L，IAA使用则相对较少。李正平［22］将ATB用于月季组织培养的研究，发现生根的有效浓度为0.5～10.0 mg/L，生根的较佳浓度为0.5～2.0 mg/L。何松林等［23］将IBA、IAA和NAA添加在萨蔓莎生根培养基中，结果证明3种激素均能促进生根，且效果最佳的配方是：1/2 MS＋IBA 0.5 mg/L、1/2 MS＋IAA 1.0 mg/L与1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L。另外，在培养基中加入适量的活性炭能有效吸附有毒物质及沉淀。姚晓惠等［24］研究发现，月季组织培养的生根阶段还受较多环境因子的影响，温度为21℃时生根的长势最好；且日光灯更适于月季的生根。

月季组培技术相对成熟，已有许多优良月季品种如卡罗拉、多情玫瑰、金太阳、芳纯月季等多种研究对象及成果［25］，为月季快繁技术研究提供参考。本文在前人研究的基础上，对丰花月季杏花村进行组培快繁试验，使其具有优良遗传特性和表型特性，同时缩短育种周期，以解决三亚地区月季育苗难问题，并建立适合三亚的月季组培育苗技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料

外植体材料取自亚龙湾国际玫瑰谷，采健壮、芽点饱满的杏花村枝条作为材料。试验在三亚市南繁科学技术研究院的组培快繁实验室及大棚中完成。

1.2 方法

1.2.1 外植体处理

外植体材料的处理：将采样枝条进行2 h的流水冲洗，随后分别将各芽点剪成5 cm左右茎段，茎段含1～2个芽点，外植体在超净工作台下用洗涤剂消毒2次。消毒：先用75%酒精浸泡3 min，用无菌水湿润3次，再用0.1%氯化汞浸泡15 min，加一滴吐温，轻轻搅拌，然后用无菌水润洗5遍。消毒完毕，进行接种试验，将消毒好的茎段处理至1 cm左右的长度，各个茎段都含有一个芽点，相接种至培养基中。

1.2.2 培养基设计

1.2.2.1 启动诱导培养基

现选用WPM、MS、1/2 MS 3种培养基类型，添加0.5 mg/L的山农（外植体型）抑制污染，且每次选用30个芽节用于以下培养基进行水平正交试验：（1） 空白对照；（2） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；（3） WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（4）WPM＋6-BA2.0mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（5） 1/2 MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（6）1/2MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.05mg/L；（7）1/2MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.2mg/L；（8）MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（9）MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.1mg/L；（10）MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.05mg/L。

1.2.2.2 腋芽增殖培养基

将诱导长出的健壮新芽茎段通过无菌操作进行切割，接种到增殖培养基中进行培养。选用WPM培养基，添加6-BA、NAA、GA3和IBA四种植物生长激素，进行水平正交试验，每次接种30株新芽，且添加0.5 mL/L山农（外植体型）抑制污染。（1）空白对照；（2） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（3） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L；（4）WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（5） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（6） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L＋GA30.5 mg/L； （7）WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋IBA 0.02 mg/L；（8） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋GA30.05 mg/L；（9）WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L。

1.2.2.3 生根培养基

采用WPM培养基，添加NAA、GA3、IBA三种植物生长激素，以及0.5 mL/L山农（内生菌型）抑制污染，和0.1 g/L ACO诱导根系生长。设计水平正交试验，每次试验使用30株增殖获得的健壮无根苗。（1）空白对照；（2）WPM＋NAA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L；（3） WPM＋ NAA 0.2 mg/L＋ IBA 0.2 mg/L；（4） WPM＋GA30.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋IBA 0.1 mg/L；（5） WPM＋ GA30.1 mg/L＋ NAA 0.1 mg/L；（6）WPM＋ GA30.1 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋IBA 0.2 mg/L；（7） WPM＋ GA30.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋ IBA 0.2 mg/L；（8）WPM＋ GA30.5 mg/L＋ NAA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L；（9） WPM＋ GA30.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；

1.2.2.4 炼苗移栽

将生根培养基中生长健壮并且根部发育良好的组培苗，从无菌培养室转移至温室大棚，进行为期一周炼苗。一周后打开培养瓶瓶盖，将组培苗取出用500～600倍的多菌灵溶液浸泡10 min，且洗净根部残留的培养基。然后放在阴凉通风处静置晾干3～5 min，再移栽至蛭石中观察15 d，记录其生长过程及成活率［15］。

1.2.3 数据处理

用Excel 2010进行数据归纳整理，用SPSS 16.0统计软件对记录的数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基组合对杏花村腋芽诱导的影响

从表1的正交试验可知，不同植物生长素浓度配比对杏花村月季初代诱导培养的各处理间差异显著。结果表明，生长调节剂对腋芽的诱导有一定的作用。其中WPM＋6-BA 1.0＋NAA 0.1 mg/L效果最为显著。当6-BA浓度为1.0 mg/L，NAA浓度为0.1 mg/L时，叶片绿而健壮无愈伤，生长良好，诱导率较高，而外植体在无任何生长调节剂的WPM培养基中，虽能够诱导腋芽发芽，但生长状况一般，芽个数较少、诱导率较低。当培养基配方中的6-BA浓度为2.0和0.5 mg/L，NAA浓度为0.2和0.05 mg/L时，虽诱导腋芽的生长，但是植株生长状况一般，叶黄较多，生长势弱，说明在诱导培养阶段生长调节剂的浓度过高或过低，不仅不利于腋芽分化，还可能抑制植株的正常生长，使叶片变黄。3种培养基类型中MS培养基最适宜植株生长，植株生长状况较好，叶绿，高大健壮，但芽苗个数较少，诱导率较低。月季品种间的基因型各异和培养基配方有差异，不同浓度的生长调节剂组合对月季的腋芽诱导起不同作用。根据诱导的平均芽数和生长状况来看，WPM＋6-BA1.0mg/L＋NAA 0.1 mg/L是杏花村腋芽诱导的最适培养基（图1）。

图1 腋芽诱导培养的生长发育过程

表1 不同培养基组合腋芽诱导的影响

2.2 不同培养基组合对杏花村腋芽增殖的影响

由表2可看出，杏花村月季的腋芽增殖效果差异显著。WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L的增殖效果较好，增殖率显著高于其他处理，植株长得好，叶绿，产生的愈伤较少，成活率高。而腋芽在无任何生长调节剂的WPM培养基中，虽然能增殖，但生长比较差，叶黄，成活率极低。6-BA＋NAA＋GA3处理增殖效果较6-BA＋NAA和6-BA＋IBA差，叶黄，愈伤多，成活率低。结合芽的增殖率、成活率和生长状况看，WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L为最适合的腋芽增殖培养基（图2）。

图2 腋芽增殖培养的生长发育过程

表2 不同培养基组合腋芽增殖的影响

2.3 不同培养基组合对杏花村腋芽生根的影响

由表3可以看出，不同浓度的激素配比对杏花村月季的腋芽生根效果的差异显著。其中WPM＋GA30＋NAA 0.2 mg/L＋IBA 0.2 mg/L，培养配方的效果最为显著。从方差分析情况看，当IBA浓度为0.2 mg/L、NAA浓度为0.02 mg/L时，腋芽的平均根数为2.05根，平均株高为0.68 cm。相比其他处理，腋芽生长良好，叶片翠绿，高大健壮，根系发达，成活率高。而腋芽在无任何生长调节剂的WPM培养基中，虽可以达到生根的效果，但生长一般，较健壮，叶较绿，根系较发达。而WPM＋GA30.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L植株生长状况较差，生长势弱，叶黄，根系不发达，大面积死亡成活率低。根据腋芽的平均株高、平均根数、成活率和生长状况来看，最适合腋芽生根培养的培养基为WPM＋NAA0.2mg/L＋IBA0.2mg/L（图3）。

表3 不同培养基组合腋芽生根的影响

图3 腋芽生根培养的生长发育过程

2.4 组培苗驯化成活率

以蛭石为基质，组培苗放在室外培养，随着时间的变化，适应生长环境的植株，将会长出新叶，叶片数为2～3片，后期生长健壮会长出丛生芽，生长势较弱的植株会慢慢表现出叶片枯黄，根部发黑。炼苗一周后，成活率为90%左右；炼苗两周后，成活率为70%左右。说明丰花月季杏花村组培苗在三亚移栽驯化具有可行性。

3 讨论与结论

本试验研究了不同植物生长调节剂组合对丰花月季杏花村的腋芽诱导、增殖以及生根的影响。外植体的消毒处理与无菌操作在组培试验中尤为重要，与吴林森等［26］提出的观点相同。本试验在外植体的消毒阶段，另使用了山农试剂对枝条中存在的细小毛刺进行消毒处理，可更大程度上抑制污染发生。

在试验中，发现MS培养基最适宜植株生长发育，与闫海霞等［27］研究认为WPM最适宜植株生长的观点不一致。结果表明，WPM诱导时间相对MS要慢一些，植株的健壮程度相比MS稍差，但WPM的诱导率相对于MS诱导率更高。因此，腋芽的诱导选用MS培养基也可行。进行腋芽的诱导时，添加2 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA，会在一定程度上使植物叶片枯黄且长势弱；将6-BA浓度调为1 mg/L、NAA浓度调为0.1 mg/L时，腋芽的诱导生长最佳。由此可见，试验中的生长调节剂6-BA与NAA的有效浓度范围与 Rout［16］和 Bressan［11］的研究相符。增殖阶段中使用GA3效果并不理想，植株生长状况差，死亡多，叶片黄，愈伤多；IBA则对腋芽的增殖有一定的促进效果。由此可见，进行月季腋芽的增殖时，GA3并不适合，IBA则可行，但相比而言，使用低浓度的6-BA和NAA更适于月季腋芽的增殖。在生根阶段由于发生温度变高导致根部变黑的情况，从而影响植株的正常生长。这与姚晓惠等［24］研究发现的结果一致，生根阶段受温度变化的影响较为显著，其最适温度为21℃。因此，本试验中，将温度控制在20～25℃，从而避免温度变化的影响。最后进行移栽培养时，经多次反复移栽观察后，丰花月季杏花村组培苗在蛭石基质中生长良好，成活率明显较高。

综上所述，丰花月季杏花村最适宜腋芽诱导的培养基为WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；最适合腋芽增殖培养的培养基为WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L；最适宜生根的培养基为WPM＋NAA 0.2 mg/L＋IBA 0.2 mg/L；组培苗驯化以蛭石为基质，在室外培养观察15 d，存活率为50%。