郭席君，谭怡平，郭研，陈思源，李玲

湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南永州 425199

近年来多肽药物的开发成本降低、周期缩短，研究进展越来越快，当下已有80余种多肽药物上市。其中，胸腺五肽通过促进和诱导T细胞分化与成熟等途径来影响免疫系统[1]，目前被用于治疗多种自身免疫性疾病。脾氨肽主要对T细胞介导的细胞免疫发挥作用，提高T细胞的活性。但是，胸腺五肽和脾氨肽在体内微环境下不稳定，存留时间短，生物利用度低，并且多数治疗自身免疫疾病的药物不具备特异性识别先天性和获得性免疫反应的能力，毒副作用较强[2]。因此，对免疫多肽药物进行结构修饰改造，载体运输等，实现多肽药物在体内的长效性与靶向治疗和提高生物利用度，具有重要的临床意义。

目前胸腺五肽和脾氨肽相关的药物在市面上多种多样，利用多肽自组装设计，研制结构类似物和衍生物；选用细胞穿透肽（CPP）类药物载体，增加多肽细胞吸收率和靶向性；共轭PEG类聚合物，增加多肽药物的生物利用度。该文对前期研究结果进行总结，在多肽免疫活性、合成设计、药物载体、靶向优化和长效性等方面综述该联合药物的前景。

1 多肽的免疫活性

1.1 细胞免疫

T细胞是细胞免疫中十分关键的物质，Th17细胞为T辅助细胞中的一个新亚群,是由Th0细胞在细胞因子IL6和IL23的条件下分化而成的辅助性T细胞,它可分泌细胞因子。Th17细胞在自身免疫病及抗感染免疫中,能够分泌白细胞介素21，形成白细胞介素21自分泌环，从而介导炎症反应并引起组织损伤[3]。在以T细胞为基础的免疫治疗中，对T细胞功能各亚群的准确识别很关键，一般采用流式细胞仪检测CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+水平[4]。蔡仪术等[5]用脾氨肽治疗可以有效纠正lgE合成分泌紊乱、增强患者的免疫功能。研究发现脾氨肽可有效缓解小儿支气管哮喘的胸闷咳嗽等症状。

在胸腺发育成熟的T细胞进入外周血中介导细胞免疫，在机体免疫方面发挥关键作用。韩慧[6]研究发现支气管哮喘研究组患者的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均显著高于对照组（P＜0.05），IgE水平显著低于对照组（P＜0.05）,研究组的有效率明显高于实验组。

T细胞亚群在机体抗病毒细胞免疫过程中起促进作用。研究发现宫颈病变越重，CD3总T细胞绝对计数、CD8抑制/杀伤T细胞计数以及CD4辅助/诱导T细胞绝对计数越低[7]。苏贺[8]研究发现胸腺五肽对恶性肿瘤患者T细胞亚群有影响。研究结果显示两组治疗后CD3+和CD3+、CD4+水平显著提高，而CD3+、CD4+、CD8+、CD25+明显降低，且观察组组中CD3+、CD4+、CD8+的增长速度更显著。臧雪锋等[9]在研究中表明胸腺五肽利于改善急性肾损伤患者的免疫功能，证明了其T细胞在免疫功能障碍方面的治疗作用。

1.2 刺激巨噬细胞分化

巨噬细胞的功能取决于内环境。作为免疫功能细胞调节的一部分，胸腺五肽能刺激未分化的巨噬细胞产生TNF-α，使其具有良好的细胞摄取滞留性能，用以保证在细胞内发挥正常生理功能[10]。从组成上看，胸腺五肽含有Arg、Lys、Asp、Val、Tyr 5种氨基酸，具有胸腺生成素Ⅱ的全部生理功能；在正常机体状态下，可增强巨噬细胞的吞噬功能，可促进各种炎性因子的分泌，诱导T细胞分化成熟，增强B细胞的功能，促进Ig G、Ig A、Ig M类型抗体的分泌等[11]。

2 多肽的自组装合成

自组装合成多肽技术，即从多肽的结构探究到设计组装，到实现对多肽手性自组装结构进行精准多级调控的技术，是进一步实现多肽功能化应用的基础。在我国自组装多肽设计处于研发起步阶段，由于发展前景好,近年来的研究成果取得了许多的新进展。Liu等[12]合成了一种由48个氨基酸组成的能够自组装并具有抗肿瘤活性的多肽，且包含能够诱导癌细胞死亡的肽段KLA，该活性肽为RADA-KLA。HuK等[13]在α-螺旋多肽自组装新模式及其在储能方面应用的研究中取得了新进展。

除了自组装和修改分子功能基外，多肽还可以分为几个片段。多肽具有良好的细胞相容性，可进行合理设计和精确剪裁，分成几个片段肽链。周建华等[14]将特立帕肽序列中的34个氨基酸分成4个片段，以Wang Rein(王树脂）和CTC Resin(2-氯三苯甲基氯树脂）为固相载体分别获得4个片段的全保护肽。随着多肽的合成与设计技术的日趋完善，现有研究成果，为探索设计出一类同时具有调节成熟T细胞和促进辅助T细胞活性等功能，对机体免疫力进行多方位精准调控的多肽奠定了基础。

受先天免疫反应的启发，李明明等[15]模仿天然蛋白质的结构特征，通过合理设计多肽序列，并进行自组装合成，获得了一种短肽可以精确预防过敏或调节自身免疫疾病，并且这种短肽已经被应用于多种癌症的免疫治疗。

3 多肽用作药物载体

3.1 药物载体

由于多肽纳米材料的药物递送系统具有良好的生物相容性和较低的毒副作用，自组装肽类药物载体可用于改善药物特性，具有缓释和靶向的作用。但是由于受其结构、亲水性、极性的影响，多肽难以透过细胞膜，影响吸收。近年来细胞穿透肽(CPP)在核酸、聚合物、脂质体、纳米粒子和低分子量药物等各种药物载体中运用甚广。它具有很强的细胞膜穿透性，通过细胞表面的特异性受体识别，将药物核酸等特异性传递至细胞内部。这些多肽易于合成表征，能够共价或非共价结合生物活性药物，通过内吞作用输送到细胞内使基因表达[16]。见图1。

图1 CPP负载药物用于细胞内传送

将新合成的多肽置于CPP内部，由CPP将多肽分子输送于细胞中，明显提高了多肽分子的靶向性和水溶性。CPP穿膜肽是一种小分子多肽，它富含精氨酸和赖氨酸，通常可以与蛋白、核酸等在细胞内产生生物活性的生物大分子相连，通过受体介导的内吞、反转微团模式等不同机制进入细胞，使得多肽可以像小分子药物一样能够穿过细胞膜，作用于细胞内的靶点发挥功能[17]。其中使用最广泛的两种阳离子CPP是由TAT介导的多肽和包含9个精氨酸的寡聚精氨酸多肽构成[18]。细胞穿膜肽TAT是一类能携带多肽等大分子物质穿过哺乳动物细胞膜的短肽，核心序列由11个氨基酸组成，由2个独立的外显子编码，第1个外显子编码前72为氨基酸，具有转录激活活性[19]。自从TAT发现以来，许多肽经常被添加到CPP上，包括人工合成的多聚精氨酸R9[15]。王浩等[20]用具有细胞穿透功能的Hsp-Tat纳米粒作为siRNA新型递送载体，该纳米粒具有良好的生物相容性及高效siRNA复合特性，可将siRNA高效递送进入细胞内，是一种高效且安全系数高的运输载体。王中山等[21]利用TAT构建NR2Pep的原核表达系统，NR2Pep是NMDA受体2B亚基羧基端来源的多肽，得到较高纯度的NR2Pep，在体外证实它具有穿过不同细胞膜的活性。

3.2 靶向性

理想的药物分子是高药效性、低毒性和强靶向性等性质为一体的高综合性药物分子。提高药物的靶向性将明显地降低药物的毒副作用。靶向性已成为衡量一种药物是否优劣的重要指标之一，但由于大多数的多肽细胞渗透能力差，无法精确识别用药部位，需要对多肽的结构进行改造或利用一些高渗透性的小肽来改善多肽的细胞渗透能力。THP是一种肿瘤微环境中存在的小肽，它可以修饰包裹药物的纳米颗粒表面，将药物靶向输送至肿瘤组织中[23-23]。多肽药物的靶点最主要的是G蛋白偶联受体，拓扑构象为7次跨膜转运的受体，通过与配体相互作用，使其分子构象发生变化，产生信号传递。它在现代的多肽药物研发中占据重要地位，大约有50%的药物采用它作为药物靶点。

整合素亲和肽RGD是一种含有Arg-Gly-Asp的三肽，普遍存在于细胞外基质蛋白中，是整合素蛋白识别位点，同时具有信号分子传递功能,可作用于体内多种具有生理活性的反应[24]。郑延延等[25]用丙烯酸等离子体处理将RGD整合到PEEK上，见图2。将多肽药物融合到RGD可实现多肽药物肿瘤靶向性的目的[26]。崔梅英等[27]研究显示RGD-ELPs融合蛋白具有较强的促进细胞黏附作用，黏附细胞的数量与蛋白质浓度成正比。可依据此原理,将联合胸腺五肽与脾氨肽设计出的多肽整合到小分子靶向肽RGD中,提高该复合多肽在机体内的靶向性。在肿瘤治疗中，为了提高肿瘤细胞的靶向性,筛选肿瘤中高特异性受体和配体，进行人工合成和设计序列，构建靶向功能肽段。邱敏[28]设计合成了一个疏水性2-氨基十六烷酸N-羧基内酸酐（APA-NCA）单体，从而构建了一系列多功能聚脂肽胶束和囊泡纳米平台，实现了对小分子抗癌药物的肿瘤靶向递送。还可选择免疫应答反应中特异性高表达的受体作为靶标，制备融合多肽药物的靶向功能多肽。

图2 等离子体处理PEEK表面和化学键合RGD肽的过程示意图

4 多肽药物长效性

由于多肽在体内微环境下易降解，延长多肽药物半衰期是目前多肽药物的研究重点。常用PEG修饰和聚多肽融合技术提高多肽及蛋白质药物的半衰期。PEG修饰剂可与多肽多个部位的氨基、羧基、羟基和巯基进行反应，通过减少代谢和体循环中受体介导的对蛋白质的吸收，达到降低血浆清除率。在不同环境下PEG修饰产物的异构体均有差异，可采取酶催化PEG定位修饰的方法，对β-LG的Gln残基进行定点修饰，可最大限度地提高多肽的生物学利用效率[29]。PEG修饰磁性纳米粒子后，可增加血液循环时间，增加药物传递系统的滞留时间[30]。聚多肽融合技术相比PEG修饰，避免了体外化学偶联和修饰后纯化步骤，具有生物可降解性，可避免在细胞和器官中蓄积,一般是通过增加分子大小或改变电荷性质来减少肾清除，延长药物半衰期[31]，见图3。赵市超等[32]研究发现经聚合物修饰过的GO热稳定性明显提高。

图3 聚多肽融合技术延长半衰期的原理示意图

5 结论

多肽药物具有选择性强、特异性高和毒副作用低的优点。近年来，在研究抵抗各种由于免疫力低下而引起的癌症等疾病的治疗药物中多肽药物受到广泛关注。但由于多肽药物的自身缺陷导致目前上市的多肽类药物并不多。未来，可以在多肽分子结构的基础上进行研究，克服无靶向性和药效低的缺陷，具体将现有多肽先导物进行官能团优化，结合生物信息学和高通量组合化学等方法进行有效和合理的设计与改造，进一步实现在体内作用时间长、特异靶向性和高活性的目标。