陈玉林 贺小云 刘玉芳 储明星

摘要 [目的]探究綿羊繁殖性状相关候选基因ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1在小尾寒羊性腺轴组织（大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管）的表达差异，为阐明绵羊发情期调控分子机理提供理论依据。[方法]以FecB BB型小尾寒羊为研究对象，利用实时荧光定量PCR检测上述6个基因在小尾寒羊黄体期和卵泡期与性腺轴相关的7种组织中的表达差异。[结果]ATF4在小尾寒羊黄体期卵巢组织中的表达量最高且极显著高于卵泡期（P<0.01）;CCNG1在小尾寒羊黄体期卵巢组织中的表达量最高，在卵泡期大脑组织中的表达量极显著高于黄体期（P<0.01）;KDM3B在小尾寒羊黄体期小脑中的表达量最高，且黄体期小脑和下丘脑中的表达量均显著高于卵泡期（P<0.05）;NPTX1在小尾寒羊黄体期小脑中的表达量最高且显著高于卵泡期（P<0.05）;PLCB3在小尾寒羊黄体期卵巢中的表达量显著高于卵泡期（P<0.05）;RASD1在小尾寒羊卵泡期垂体组织中的表达量最高，在黄体期大脑、小脑、子宫中的表达量显著高于卵泡期（P<0.05）。[结论]ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1基因可能对绵羊的发情期转换起到一定的调控作用，为进一步阐明绵羊发情期转换过程的分子机理提供了新思路，为进一步研究上述6种基因的功能奠定了理论基础。

关键词 绵羊;发情期;性腺轴;候选基因;组织表达

中图分类号 S 826  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）21-0105-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.026

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Expression Analysis of Genes Related with Estrus in the Gonadal Axis of Small Tail Han Sheep

CHEN Yu-lin  HE Xiao-yun LIU Yu-fang 2 et al

（1.Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193; 2.College of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan， Hebei 056001）

Abstract [Objective]To explore the expression differences of candidate genes（ATF4， CCNG  KDM3B， NPTX  PLCB3 and RASD1）related with the reproduction traits in the gonadal axis tissues （cerebrum， cerebellum， hypothalamus， pituitary， uterus， ovary， fallopian tube） of Small Tail Han Sheep，  so as to provide references  for elucidating the molecular mechanism of sheeps estrus regulation.[Method]Taking FecB BB Small Tail Han Sheep as the research object， real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression differences of the above 6 genes in 7 kinds of tissues related with gonadal axis of Small Tail Han Sheep in follicular phase and luteal phase， respectively. [Result] The expression of ATF4 in ovarian tissue of Small Tail Han Sheep in luteal phase was the highest and significantly higher than that in follicular phase （P< 0.01）. The expression of CCNG1 in the ovarian tissue of Small Tail Han Sheep was the highest in luteal phase of Small Tail Han Sheep， and its expression in the brain tissue in the luteal phase was significantly higher than that in the follicular phase（P< 0.01）. The expression of KDM3B in cerebellum of Small Tail Han Sheep in luteal phase was the highest， its expression in the cerebellum and hypothalamus in the luteal phase were both significantly higher than that in the follicular phase（P<0.05）.  The expression of NPTX1 in cerebellum in luteal phase was the highest and significantly higher than that in follicular phase（P<0.05）. The expression of PLCB3 in ovary of Small Tail Han Sheep in luteal phase was significantly higher than that in follicular phase（P<0.05）. The expression of RASD1 in the pituitary of Small Tail Han Sheep was the highest in the follicular phase， and the expression in the brain， cerebellum and uterus in the luteal phase was significantly higher than that in the follicular phase（P<0.05）.  [Conclusion]  ATF4， CCNG  KDM3B， NPTX  PLCB3 and RASD1 genes might play a certain role in regulating the estrus conversion of sheep， which provided a new idea for further elucidating the molecular mechanism of estrus conversion process in sheep， and laid the theoretical basis for further research on the functions of the 6 above genes.

Key words Sheep;Estrus;Gonadal axis;Candidate genes;Tissue expression

基金项目 国家自然科学基金项目（31772580）;国家肉羊产业技术体系专项（CARS-38）;中国农业科学院科技创新工程项目（ASTIP-IAS13）。

作者简介 陈玉林（1997—），男，河南驻马店人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种。

*通信作者：刘玉芳，讲师，博士，从事动物遗传育种研究;储明星，研究员，博士，从事羊优异繁殖性状分子机理研究。

收稿日期 2021-01-30

排卵数和产羔数是决定绵羊繁殖力高低的重要因素。一般情况下绵羊排卵数为1～2个，但其数量不绝对，研究表明一些羊的排卵数在10个左右[1]。绵羊繁殖力受到复杂因素的调控，包括营养物质、遗传因子以及羊群中的性别比例等，其中遗传因素对绵羊繁殖力的影响较大[2]。通过对FecB基因的研究发现，携带该基因的母羊在排卵数方面存在剂量效应，即每增加一个拷贝数，其排卵数可增加1.5个，产羔数可增加1.0～1.5个[3-4]。该基因的发现为选育高繁殖力母羊提供了研究方向。发情期作为动物繁殖过程中的重要时期，具有研究遗传因素对绵羊繁殖力作用机制的重大意义。近些年研究发现，发情相关基因ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1都對绵羊的繁殖力有一定的影响，探究这些基因在多羔绵羊发情期性腺轴相关组织中的表达差异对于阐明绵羊多羔分子机理具有重要意义。

前人研究发现，激活转录因子4（activiting transcription factor  ATF4）结合基序存在于多种时钟基因中，包括PER2、PER3、Cry1、Cry2和Clock。ATF4与PER2启动子结合并激活其转录，参与动物发情周期的调控过程[5]。大鼠卵巢ATF4敲除会导致卵母细胞数量减少，表明ATF4在排卵中有着以前未知的作用[6]。细胞周期蛋白G1（Cyclin G CCNG1）是一种细胞周期蛋白G家族蛋白，参与哺乳动物颗粒细胞增殖、卵母细胞成熟等繁殖生物学过程[7]。研究表明，CCNG1可能通过参与卵泡的生长发育，继而达到对绵羊发情和季节性繁殖的调控[8]。组蛋白去甲基化酶3B（lysine demethylase 3B，KDM3B）基因敲除雌性小鼠发情周期延长，排卵能力下降，受精率下降，且在子宫中的胚胎植入位置也显著减少，这可能是排卵和受精减少的结果[9]。KDM3B基因敲除雄性小鼠存在精子发生缺陷，并且由于生殖细胞中CREM介导的基因表达受损而导致不育[10]。因此，KDM3B是维持正常发情周期、排卵能力和受精效率所必需的。神经元正五聚蛋白1（neuronal pentraxin  NPTX1）是神经元发育的重要分泌蛋白，编码神经元五肽 研究发现在GnRH神经元的诱导下NPTX1是最早激活的细胞外信号之一，该基因已被发现在松果体中存在昼夜差异表达（夜间表达量增加3.5倍），因此被认为是与生殖季节性表型相关的候选基因[11-12]。磷脂酶C β3（phospholipase C beta  PLCB3）是一种磷脂酶，在调节母体排卵、黄体生成、卵泡生长等方面发挥重要作用[13]。地塞米松诱导的Ras相关蛋白1（Ras related dexamethasone induced  RASD1）是Ras家族单体G蛋白的成员，在多种细胞功能中发挥核心作用，包括细胞增殖、分化、转化、分泌和凋亡，另外研究表明其在下丘脑对神经元激活的反应中起重要作用[14]。此外，RASD1是一个雌激素反应的即刻早期基因（immediate-early genes），它还调控垂体雌激素反应晚期基因的表达[15]。

笔者利用实时荧光定量PCR技术对上述繁殖相关候选基因在绵羊不同繁殖时期（卵泡期和黄体期）性腺轴组织中的表达情况进行检测，旨在为进一步揭示ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1基因的功能和解析绵羊繁殖机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品的收集

随机选取2～3周岁健康、经产的空怀小尾寒羊卵泡期和黄体期母羊各3只，于2017年10月饲养于天津市畜牧兽医研究所试验羊场，所有试验羊的饲养环境和饲料均相同，2017年11月进行屠宰，取其大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管，取样后迅速装入1.8 mL RNase-Free冻存管中（最大样品量为冻存管体积的2/3），所有样品采集要在30 min内完成，样品采集完迅速放入液氮中冷冻保存，用干冰带回实验室，放入-80 ℃冰箱中冷冻保存，备用。

1.2 RNA的提取及质量检测

将采集的小尾寒羊卵泡期和黄体期性腺轴7种组织研磨后，用Trizol试剂（Invitrogen，美国）进行裂解，此后按照动物组织RNA提取试剂盒（天根，北京）的说明书进行总RNA的提取，最后利用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000检测提取RNA的质量和浓度。经检验合格的组织总RNA置于-80 ℃下保存备用。

1.3 引物设计

根据GenBank数据库提供的绵羊ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3、RASD1、RPL19基因序列（登录号分别为NM_001142518.1、NM_001287473.1、XM_027970282.1、XM_004013084.4、XM_027959899.1、NM_001161872.1、XM_012186026.1）信息，并利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，以RPL19为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。各引物浓度均为10 μmol/L，引物序列详细信息见表1。

1.4 cDNA的合成

利用TaKaRa反转录试剂盒（PK0445）合成cDNA，反转录体系如下：1.0 μL反转录混合引物，1.0 μL Oligo dT引物，1.0 μL随机引物，4.0 μL荧光定量缓冲液，10 μL RNA，12.0 μL双蒸水，全程在冰上操作。RT-PCR反应程序如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，将反转录完成后的cDNA产物稀释后，用持家基因RPL19進行PCR检测，质量检验合格后于-20 ℃下保存，以备检测基因mRNA表达[16]。

1.5 实时荧光定量PCR

1.5.1 实时荧光定量PCR体系及反应程序。

PCR反应体系（总体积为20 μL）：10.0 μL荧光定量Ex Taq引物Ⅱ、0.8 μL上游引物、0.8 μL下游引物、2.0 μL cDNA 模板、6.4 μL双蒸水。PCR反应程序如下：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性5 s，60 ℃ 30 s，40个循环;反应结束后进行熔解曲线分析[17]。

1.5.2 标准曲线的建立。

将cDNA样本5倍稀释后，进行2倍梯度稀释后获得5个浓度梯度（1、1/2、1/4、1/8、1/16）的cDNA样品。用这些cDNA作为模板，对目的基因和持家基因进行荧光定量PCR，以浓度梯度的对数值（以10为底数）为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制目的基因和持家基因的标准曲线。

1.5.3 实时荧光定量检测与数据分析。

使用Roche Light Cycler480 Ⅱ 型荧光定量PCR仪进行荧光定量检测，采用Excel软件进行数据处理，用2-△△Ct的方法计算基因的相对表达量。获得的表达量数据使用SPSS 19.0软件进行独立样本T检验。

2 结果与分析

2.1 RNA的提取

提取后的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果发现28S条带明显亮于18S条带，条带完整性较好，表明该RNA质量合格，可用于后续试验。

2.2 ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3、RASD1基因组织表达分析

2.2.1 ATF4基因组织表达检测。

实时荧光定量PCR结果显示，ATF4基因在7种组织中均有表达，其中在小尾寒羊黄体期的卵巢组织中的表达量最高且极显著高于卵泡期（P<0.01）;ATF4基因在其他组织中的表达量差异均不显著（P>0.05）（图1）。

2.2.2 CCNG1基因组织表达检测。

小尾寒羊2个繁殖时期的7种组织中，CCNG1基因在小尾寒羊黄体期卵巢组织中的表达量最高;CCNG1基因在卵泡期大脑组织中的表达量极显著高于黄体期（P<0.01），但其在其他组织中的表达量差异均不显著（P>0.05）（图2）。

2.2.3 KDM3B基因组织表达检测 。

如图3所示，KDM3B基因在小尾寒羊黄体期小脑组织中的表达量最高;KDM3B基因在黄体期小脑和下丘脑组织中的表达量显著高于卵泡期（P<005）;KDM3B基因在其他组织中的表达量差异均不显著（P>0.05）。

2.2.4 NPTX1基因组织表达检测。

如图4所示，NPTX1基于在小尾寒羊黄体期小脑组织中的表达量最高且显著高于卵泡期（P<0.05）;NPTX1基因在其他组织中的表达量均无显著差异（P>0.05）。

2.2.5 PLCB3基因组织表达检测。

如图5所示，PLCB3基因在小尾寒羊2个繁殖时期卵巢组织中的表达量均最高，黄体期卵巢组织中该基因的表达量显著高于卵泡期（P<005），其在其他组织中的表达量无显著差异（P>0.05）。

2.2.6 RASD1基因组织表达分析。

如图6所示，RASD1基因在小尾寒羊卵泡期垂体组织中的表达量最高;在黄体期大脑、小脑、子宫中该基因的表达量显著高于卵泡期（P<005），而其在卵泡期卵巢、子宫、输卵管呈痕量表达。

3 讨论

哺乳动物的繁殖性能受到复杂的激素和分子网络的调节，其中下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴是最基本和最重要的调节途径，也起到调节生殖功能的关键作用[18]。研究表明，对小鼠、绵羊、斑马鱼和三穗鸭等的研究发现相关基因能够影响性腺轴，从而参与到繁殖的调控之中[19-22]。发情期是动物繁殖的重要环节，研究动物发情期的调控机制对于动物繁殖力的提高具有重要意义，因此探究发情相关候选基因在性腺轴组织中的表达差异对于阐明小尾寒羊高繁殖力的机理具有一定的促进作用。

ATF4是一种应激性转录因子，又称环腺苷酸（cAMP）连接效应元件2（cREB2），与氨基酸转运和代谢、抗氧化应激、蛋白质稳态和钙释放密切相关，也可以诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞和衰老，是内质网重要的调节因子，且在早期胚胎发育中起着十分重要的作用[23]。研究发现，ATF4可以结合VEGF启动子中发现的4种氨基酸反应元件来上调VEGF表达，增加新生血管的形成[24]。该试验发现ATF4在小尾寒羊性腺轴的7种组织中均有表达，且黄体期卵巢中的表达量显著高于卵泡期，由于黄体形成过程中伴有血管生长，因此推测其通过促进卵泡膜内层毛细血管的生长，从而促进小尾寒羊黄体的形成，在黄体期至卵泡期的转变中起到调控作用。

细胞周期蛋白G1（CCNG1）是细胞周期蛋白G1/MDM2/p53轴的关键组成部分，其表达与促进生长和细胞周期进程相关[25-26]。研究发现，该基因在发情期和发情后期卵巢中的表达量存在显著的品种间差异，因此推断其可能通过参与卵泡的生长发育，继而达到对绵羊发情和季节性繁殖的调控[8]。该试验中CCNG1基因在小尾寒羊性腺轴7种组织中均有表达，与前人研究结果相符合，且2种时期大脑组织中的表达量存在极显著差异（P<001），而其在其他组织中的表达量均无显著差异（P>005），初步推测其参与卵泡期大脑神经元细胞的生长增殖，从而调控性腺轴中下丘脑以及垂体活性，以此参与小尾寒羊卵泡期与黄体期的转换过程，该基因的具体作用机制值得进一步探究。

KDM3B是组蛋白赖氨酸去甲基酶（KDMs）中KDM3家族的重要成员[9]。组蛋白赖氨酸去甲基酶（KDM）首次在哺乳动物中被发现，能去除组蛋白底物上的甲基，并通过赖氨酸去甲基化的作用在细胞增殖中发挥作用[27]。目前已在多种肿瘤相关的疾病中发现KDM3B的调控作用，如前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌[28-31]，这些结果表明KDM3B在细胞周期调控中是一个关键的表观遗传因子。该试验发现KDM3B基因在小尾寒羊性腺軸7种组织中均有表达，表明该基因可能与繁殖相关，且在黄体期下丘脑中的表达量显著高于卵泡期，初步推测其通过促进下丘脑细胞GnRH的分泌来动态调节FSH和LH的含量，进而参与小尾寒羊卵泡期至黄体期的激素调控。

NPTX1属于神经元正五聚体蛋白（neuronal pentraxins，NPTX/NPs），它是正五聚蛋白（pentraxins，PTX）的一个超家族成员。正五聚蛋白主要为促炎或抗炎细胞因子，NPTX1主要在大脑皮质、海马、小脑中表达[32]，属于以钙依赖性方式与多种蛋白质相互作用的NPTX家族成员，在突触可塑性中发挥一定的作用[33]。研究发现，NPTX1与KDM3B一样都属于表观遗传调控基因，并通过过表达抑制细胞的生长增殖、侵袭和血管生成，在许多癌症中起到抑制作用[33-36]。该试验中该基因在性腺轴7种组织中均有表达，小脑中表达最高且黄体期显著高于卵泡期，与预期结果相一致，推测其通过调控小脑中枢神经元的活性对小尾寒羊的生殖活动起抑制作用，参与黄体期到卵泡期发情状态的转换。

PLCB3是由2个G蛋白α亚基（α-Q和α-11）以及G蛋白β和γ亚基激活的，在启动受体介导的信号转导中起重要作用[37]。磷脂酶（PLC）是一大类酶，能将磷脂水解成脂肪酸和其他亲脂性物质，在炎症、细胞生长、信号转导、细胞死亡和维持细胞膜磷脂等过程中起重要作用[38]。研究发现，该基因在排卵期大小的卵泡细胞中高表达，具有激活LH/LHR信号的作用[39]，并在芬兰绵羊中鉴定出该基因与产羔数相关[40]。该试验中PLCB3基因在性腺轴7种组织中均检测到表达，其在卵巢中的表达量最高且黄体期显著高于卵泡期，与前人结果相符，推测其在小尾寒羊从黄体期向卵泡期的转换过程中激活LH/LHR信号，促进小尾寒羊发情启动的过程。

RAS超家族具有信号转导调节功能，其信号通路在细胞增殖调控中起着关键作用[41]，RASD1是RAS超家族中编码小GTP酶的30 ku的G蛋白成员[42]，可作为受体非依赖性的鸟嘌呤核苷酸交换因子发挥作用[43]。在视交叉上核（SCN）中，RASD1在夜间表达较高水平的昼夜节律性，下丘脑中RASD1的表达则主要受到糖皮质激素以及血浆渗透压的影响[15，44]。研究发现，RASD1是垂体前叶细胞中雌激素反应的即刻早期基因，调控垂体雌激素反应晚期基因的表达[14]。该试验中RASD1基因在卵泡期垂体组织中表达量最多，与预期结果相一致，说明该基因在垂体水平经由雌激素的调控发挥局部作用，且黄体期大脑、小脑、子宫中的表达量均显著大于卵泡期，推测其在黄体期受到黄体分泌雌激素的影响，然后通过参与垂体GnRH神经元的激活，从而诱导小尾寒羊卵泡期的启动，调控小尾寒羊繁殖活动。

该试验利用实时荧光定量PCR探究了ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1在卵泡期和黄体期的小尾寒羊性腺轴7种组织中的表达量差异，结果表明ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1基因在卵泡期、黄体期性腺轴相关组织中的表达有较大差异，表明这6个基因可能对绵羊繁殖力具有一定的调控作用，可为进一步阐明绵羊高繁殖力的分子机理提供参考。

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