王小明，蒋婷奇，谭跃浪，方 蕾

（1.浙江巨泰药业有限公司，浙江 衢州 32400；2.普洛药业股份有限公司，浙江金华 322199）

阿莫西林是一种β-内酰胺类的青霉素类抗菌素，临床上广泛使用。可治疗多种细菌感染引起的疾病，包括喉炎、肺炎、皮肤感染、泌尿道感染等[1]。我国有207 个阿莫西林胶囊批准文号。某公司产品自获批以来，一直执行《中国药典》标准[2]。根据《国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》（国办发〔2016〕8 号）要求，进行阿莫西林胶囊一致性评价质量研究[3]。以2015 年版《中国药典》（二部）（ChP2015）收载质量标准为依据，参考美国药典40 版（USP40）、《日本药典（17版）》（JP17）、《英国药典2017 版》（BP2017）等质量标准，对有关物质的分析方法进行优化[4-6]。

1 实验部分

1.1 仪 器

Agilent 1260 高效液相色谱仪，包括Agilent VWD、Agilent Openlab CDS 工作站；XS 105 电子天平，精度1/105；XPE26电子天平，精度1/106。

1.2 试 剂

实验所用对照品请见表1。

表1 实验品对照Tab 1 List of reference substances

阿莫西林胶囊，自制产品，批号分别为Q02171201、 Q02171202、 Q02171203， 规 格 为0.25 g；参比制剂：持证商为Beecham Group plc，批号2368，规格为0.25 g。

磷酸二氢钾、氢氧化钾，分析纯；甲醇，色谱纯；水，超纯。

2 结果与讨论

2.1 方法筛选

阿莫西林胶囊质量标准在《中国药典》2015 年版（二部）（ChP2015）、美国药典40 版（USP40）、《日本 药 典（17 版）》（JP17）、《英 国 药 典2017 版》（BP2017）均有收载，其中USP40中只收载了阿莫西林有关物质，胶囊未收载有关物质检查项；BP 阿莫西林原料和胶囊的质量标准均包含有关物质检测项，检测方法基本相同；EP 收载了阿莫西林原料的质量标准，与BP标准基本一致。

2.1.1 不同有关物质方法比较

分别配制杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质I、杂质J、杂质L溶液及阿莫西林与以上各杂质的混合溶液作为系统适用性溶液，使用ChP2015、EP9.0 及USP40 有关物质方法分别进样，色谱见图1～图3。

图1 《中国药典》系统适用性溶液色谱Fig 1 Applicable solution chromatogram of Chinese Pharmacopoeia system

图2 EP系统适用性溶液色谱Fig 2 Applicable solution chromatogram of EP system

由图1～图3 可知，《中国药典》及EP 杂质F均为负峰，且杂质D、杂质E 及杂质J 均有未检出情况，USP 各杂质均能检出并且能够有效分离。《中国药典》及EP 的检测波长均为254 nm，该波长为阿莫西林的最低吸收波长，不利于有关物质的检测。

图3 USP系统适用性溶液色谱Fig 3 Applicable solution chromatogram of USP system

综上所述，选择USP 有关物质分析方法为本品的有关物质分析方法。

2.1.2 色谱柱选择

采用不同厂家的色谱柱，以USP有关物质分析方法对系统适用性溶液进行考察，Ultimeate AQC18 4.6 mm×100 mm，5 μm色谱柱，杂质A与杂质B重合；Spursil C18 4.6 mm×100 mm，5 μm色谱柱，杂质A 与杂质B 分离不佳，杂质E2 与杂质C 重合；Pack ODS-AQ 4.6 mm×100 mm，5 μm 色谱柱，杂质A 与主峰重合；ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm色谱柱，各杂质分离良好，见图4。

图4 ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm系统适用性溶液色谱Fig 4 Applicable solution chromatogram of Thermo(ODS HYPERSIL 4.6×100 mm,5 μm)system

故使用色谱柱ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm订入质量标准。

2.1.3 3批样品检测结果比较

对工艺验证3 批样品使用变更前《中国药典》、变更后的有关物质方法分别进行检测，考察杂质检出个数及杂质检出量，变更后方法在杂质检出个数上优于变更前的方法，结果见表2。

表2 阿莫西林胶囊有关物质分析方法变更前后比较Tab 2 Comparison before and after the change of analytical methods for related substances in amoxicillin capsules

2.2 分析方法的验证

待验证的方法为：取样品适量，精密称量，加流动相A 溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含阿莫西林（按C16H19N3O5S计）1.25 mg的溶液，过滤，取续滤液作为供试品溶液；另取阿莫西林对照品适量，精密称量，加流动相A溶解并定量稀释制成每1 mL中约含阿莫西林（按C16H19N3O5S计）12.5 μg的溶液，作为对照溶液。照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0512）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm）；以2.72 g/L磷酸二氢钾溶液（以1 mol/L的氢氧化钾或质量分数20%磷酸调节pH 至5.0）为流动相A；甲醇为流动相B；检测波长为210 nm；体积流量1.5 mL/min；柱温40 ℃，样品温度4 ℃。按表3线性梯度洗脱。

表3 梯度洗脱程序Tab 3 Table of gradient elution procedures

精密量取供试品溶液及对照品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱，供试品溶液中如有杂质峰，按外标法以峰面积计算，杂质A（相对保留时间为0.78）的质量分数不得大于0.5%，其他单个杂质的质量分数不得大于1.0%，总杂的质量分数不得大于5.0%，供试品溶液色谱中小于对照溶液主峰面积0.03倍的峰忽略不计。

参照文献[7]等，对本样品的有关物质测定方法进行了方法学验证。

2.2.1 系统适用性及仪器精密度

取系统适用性溶液连续进样6针，计算保留时间及峰面积的相对标准偏差（RSD）。结果表明，杂质与杂质、杂质与主峰之间分离度均≥1.5，6 针保留时间RSD≤1.0%，主峰、杂质峰面积的RSD分别≤2.0%、≤5.0%。表明该方法系统的影响及仪器精密度良好。

2.2.2 滤膜吸附

将系统适用性溶液及供试品溶液用0.45 μm的水相膜过滤。分别弃去不同初滤液进样，与未过滤或离心样品进行峰面积的比较，记录色谱。结果表明，系统适用性溶液及供试品溶液滤膜均无吸附。

2.2.3 专属性

分别进样杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质I、杂质J、杂质L、杂质M、阿莫西林、阿莫西林与各杂质混合溶液、空白溶剂、空白辅料，记录色谱。结果表明，各杂质及阿莫西林单独进样与混合进样保留时间一致，空白溶剂及空白辅料无干扰。

2.2.4 定量限

精密称取各杂质对照品及阿莫西林对照品适量，用稀释剂依次稀释进样，直至信噪比（S/N）至10～20，作为定量限溶液。再平行配制6 份定量限含量溶液，进样，计算精密度。定量限的质量浓度ρ和相当于样品的质量浓度的分数w如表4所示。

表4 定量限结果汇总Tab 4 Summary of limits of quantitation results

由表4可知，各杂质及阿莫西林保留时间精密度RSD符合规定。

2.2.5 检测限

精密移取定量限含量溶液3 mL 置10 mL 容量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，配制成检测限溶液，进样，检测结果如表5。

表5 检测限结果汇总Tab 5 Summary of detection limit results

2.2.6 线性与范围

以阿莫西林对照品及各杂质对照品分别配制对照含量的30%、50%、80%、100%、120%及杂质含量限的溶液分别进样。以质量浓度ρ为横坐标，响应因子为纵坐标，以定量限浓度到120%含量进行线性回归计算，r≥0.990、响应因子RSD≤10%、y0/y100≤25%（y为纵轴，y0/y100表示在y轴上的截距），并计算校正因子。结果见表6。

表6 线性与范围结果Tab 6 Summary of linear and range results

由表6可知，各杂质及阿莫西林在实验浓度范围内与峰面积均呈显著线性关系。

2.2.7 准确度

采用加样回收。配制供试品含量的样品溶液，分别加入杂质含量限度的50%、100%、120%的杂质溶液，每个含量平行配制3 份，分别计算9份样品的回收率并计算平均回收率及RSD。结果表明，各杂质回收率均在92%～105%，RSD≤2%。

2.2.8 精密度、重复性

配制对照品溶液1份，供试品溶液6份分别进样，计算6份供试品的杂质质量。结果表明，重复性各样品杂质个数与杂质质量无明显差异，即重复性良好。

2.2.9 溶液稳定性

精密称取阿莫西林对照品、样品约14.5、29 mg，置20 mL 量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，4 ℃放置，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 进样，考察主成分峰面积的变化情况。结果表明：对照品溶液在4 ℃条件下，8 h内稳定。

2.2.10 耐用性

取对照品溶液及供试品溶液，适当的调节柱温、流动相A 的pH 及不同色谱柱，考察色谱条件变化后的有关物质结果情况。结果表明。通过考察柱温（±2 ℃）、流动相A 的pH（4.98～5.10）、色谱柱的改变，供试品杂质个数与杂质量均无明显差异，本法耐用性良好。

3 结 论

1）通过对不同国家药典中阿莫西林胶囊有关物质方法进行对比研究，《中国药典》及EP杂质F均为负峰且杂质D、杂质E 及杂质J 均有未检出情况，USP各杂质均能检出并且能够有效分离。《中国药典》及EP的检测波长均为254 nm，该波长为阿莫西林的最低吸收波长，不利于有关物质的检测。故参照USP 阿莫西林原料有关物质方法建立本产品的有关物质测定方法。

2）通过对不同批号色谱柱的考察，将色谱柱厂家及型号规格订入质量标准（色谱柱为ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm）。

3）进行系统适用性与仪器精密度、滤膜吸附、专属性、定量限、检测限、线性与范围、准确度、精密度、溶液稳定性、耐用性实验，结果均符合要求，表明本研究中建立的方法准确、真实，对本品杂质能更有效分离。新建方法每针运行时间为31 min，比ChP2015少24 min，且流动相组成中有机相比例更低，对阿莫西林胶囊有关物质测定方法提供借鉴。