白 雯 白泽坤 陈未希 吴景华

华北理工大学附属医院检验科 河北唐山 063000

原发性肝癌简称肝癌，是发生于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，是人类最常见的恶性肿瘤之一，其中70%～85%为肝细胞癌(HCC)[1]。尽管目前治疗肝癌的手段众多，但其死亡率仍在肿瘤相关致死率中居第二位[2]。肝癌组织恶性程度较高，治疗方法复杂、易转移、发病机制复杂都是导致肝癌致死率高的因素[3-4]。早期肝癌起病隐匿，诊出率较低，大多数患者确诊时已处于晚期，也是导致肝癌患者远期预后差、5年生存率低的重要原因。因此,探讨肝癌发生、发展、转移、耐药机制对于提高患者预后具有重要价值[5]。

1 表观遗传学的概述

表观遗传学是指在不发生DNA序列改变前提下，通过DNA甲基化、非编码RNA活性改变、组蛋白修饰和染色质重构、RNA甲基化等方式使基因表达发生可遗传的改变[6]。表观遗传学是近年来新兴的热门研究领域，目前表观遗传学的改变已被证实在多种代谢性疾病及恶性肿瘤疾病的发生和进展过程中发挥着重要的作用[7-8]。由于表观遗传学的改变往往在恶性肿瘤的早期就已经发生，因此，深入探索表观遗传调控的分子机制,分析其与肝癌发生、转移及耐药的关系，将有助于发现新的早期肝癌肿瘤标记物，有助于完善和丰富早期肝癌的诊断方法，为实现肝癌靶向药物的研发提供理论依据，改善肝癌患者的预后。

2 N6-腺嘌呤甲基化(m6A)修饰的概述

近年来，随着甲基化RNA免疫沉淀技术(MeRIP)、甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-Seq)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)和高通量测序等技术的不断发展，人们可以更准确、快速、灵敏的发现和鉴定RNA甲基化修饰位点和分布[9]。RNA的甲基化主要的包括N1-腺嘌呤甲基化(m1A)、m6A、3-胞嘧啶甲基化(m3C)、5-胞嘧啶甲基化(m5C)、N7-鸟嘌呤甲基化(m7G)以及RNA核糖2'-O-甲基化(Nm)。其中m6A占RNA甲基化修饰的80%以上[10-11]。

m6A的修饰因子包括三种类型：书写器(writer)也称为甲基转移酶，是一个主要由METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、RBM15和ZC3H13组合而成的复合体,其主要功能是催化RNA甲基化过程；擦除器(eraser)也被称为去甲基化酶，如ALKBH5和FTO，可以逆转已经形成的甲基化修饰；阅读器(reader)是甲基化识别蛋白，主要为RNA结合蛋白的YTH结构域(YTHDF1，YTHDF2和YTHDF3)，其主要作用是结合选择性的m6A，从而影响RNA剪接、定位、翻译和稳定性[12-13]。m6A修饰可以被甲基转移酶和去甲基化酶同时调控，是一个动态可逆的过程。m6A甲基化修饰在多种癌症中均有报道，目前已经被发现在多种恶性肿瘤中如结直肠癌、肝癌及代谢相关性疾病中具有特定功能和分子机制。

鉴于HCC在世界范围内的高发病率和死亡率，为提高早期诊出率、降低致死率，阐明其发生和进展的机制尤为关键。m6A作为新兴的研究重点，在加深我们对HCC进展机制的理解上至关重要。因此，在这篇综述中，我们总结了m6A和HCC相关研究的最新进展，包括肝癌发生和进展机制及肝癌的耐药机制。

3 m6A修饰在肝癌中的研究进展

N6-甲基腺嘌呤核苷是RNA甲基化修饰中最为普遍的一种，m6A修饰在肝癌的发生、发展及预后中都具有重要作用。Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)是m6A甲基化的关键调节因子，Chen等[14]研究发现，WTAP在肝癌组织中高表达且WTAP高表达的患者预后差，同时WTAP也是肝癌预后的独立危险因素。Chen等通过MeRIP、双荧光素酶报告基因测定以及染色质免疫沉淀等方法证实WTAP介导的m6A修饰通过HuR-ETS1-p21 / p27轴来调节肝癌细胞的G2/M期，促进HCC的进展。KIAA1429也是m6A甲基化转移酶的主要组成部分之一，其在肝癌组织中的表达明显上调且与预后相关[15]。Lan等[16]发现 KIAA1429可诱导GATA3 pre-mRNA3'UTR上的m6A甲基化，导致RNA结合蛋白HuR的分离和GATA3 pre-mRNA的降解，从而提出了一个基于m6A修饰的KIAA1429-GATA3调控模型，揭示了肝癌发生和转移过程中转录组异常调控的机制。Cheng课题组[17]也通过RNA干扰及MeRIP-PCR等方法明确了KIAA1429可通过上调ID2 mRNA的m6A修饰水平抑制ID2的表达，以此增强肝癌的迁移和侵袭能力，证明了甲基转移酶KIAA1429的升高可以促进肝癌的发生发展。Zuo等[18]的实验证明，m6A修饰可以通过稳定LINC00958的RNA转录使其上调，从而影响肝癌的预后。

Qiao等[19]通过研究发现，m6A修饰与肝癌的血管生成拟态(VM)形成密切相关，可以促进肿瘤的转移。Li课题组发现[20]肥胖相关蛋白(FTO)在肝癌组织中高表达，且高表达的患者远期生存率低，并且发现HCC组织中总RNA的m6A相对含量低于正常组织，表明FTO异位表达提示肝癌患者预后较差，并与肝癌中较低的m6A含量相关。FTO使ALKBH5在肝癌中被下调，而ALKBH5表达降低是肝癌患者生存率降低的独立预后因素。Chen等[21]研究证明，ALKBH5在体外和体内均具有抑制HCC细胞增殖和侵袭能力，他们通过Dot Blot、MeRIP-qPCR方法证实ALKBH5在肝癌细胞中通过m6A依赖的方式减弱LYPD1的表达以抑制肝癌的发生。通过以上研究我们可以发现，去甲基化酶的升高或降低均可以影响肝癌的进展及预后，且去甲基化酶之间也存在相互作用，这提示我们影响肝癌发生发展和预后的机制复杂，并不是由单一因子调控，而是由多种调控蛋白共同作用。

Zhao等[22]发现m6A“阅读器”YTHDF1的增加与肝癌患者预后不良有关，YTHDF1在调节肝癌细胞的细胞代谢和细胞周期进程中起着重要的作用。Hou等[23]通过MeRIP、LC-MS/MS等试验研究发现在HCC中，YTHDF2的减少可促进肿瘤炎症的进展、血管的重塑和转移。YTHDF2可通过降解发生m6A修饰导致稳定性发生改变的IL11和SERPINE2 mRNA来抑制肿瘤细胞和肿瘤脉管系统的迁移。同样Zhong和他的团队[24]也发现，在HCC中细胞的缺氧可以诱导YTHDF2的下调，并且YTHDF2的过表达可以抑制HCC中肝癌细胞的增殖、肿瘤生长以及MEK和ERK信号通路的激活。YTHDF2直接结合EGFR 3'-UTR的m6A修饰位点，以促进HCC细胞中EGFR mRNA的降解，从而抑制细胞增殖和生长。这些发现加深了我们对肝癌中m6A甲基化修饰的理解，为肝癌的靶向治疗提供了理论依据。

综上所述，m6A修饰在肝癌发生和发展过程中是一把双刃剑，通过甲基转移酶和去甲基化酶的双重调节使RNA甲基化修饰成为一个动态可逆的过程，m6A修饰水平升高或降低，可以通过改变RNA稳定性等方法，影响其剪接、翻译从而调控肝癌的发生和进展。因此想要将m6A及其调控蛋白作为肝癌的诊断和预后判断的指标，还需更深入研究其在肝癌中的具体作用机制。

4 m6A修饰与肝癌的耐药机制

尽管治疗肝癌的手段众多，但其死亡率仍在肿瘤相关致死率中居第二位，其3年生存率仅为12.7%，中位生存期为9个月[25]。大多数肝癌患者就诊时已处于晚期阶段，失去了手术治疗机会，需依靠化学药物治疗，但癌细胞的耐药性也是导致肝癌患者预后差、生存期短的一个重要原因。隋守光等[26]的研究表明，miRNA-433过表达可以增强肝癌细胞对多西他赛的敏感性。多项研究也证实，RNA相关的表观遗传学改变与结肠癌、胰腺癌等消化道肿瘤的耐药机制密切相关[27]。酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼是当前公认的最常见用于晚期HCC的一线药物，可显著改善无法进行手术治疗的肝癌患者的总体生存率。但在实际临床治疗中，索拉非尼治疗晚期肝癌患者的疗效欠佳，仅能将晚期肝癌患者的平均生存期延长3个月左右，而耐药性是导致肝癌对索拉非尼不敏感的一个重要原因[28]。2020年Lin 等[29]的研究发现m6A甲基化修饰在耐索拉非尼的肝癌细胞中被显著下调。并通过MeRIP-Seq分析，确定FOXO3是METTL3介导的m6A甲基化修饰的关键下游靶标。在小鼠异种移植模型中发现，METTL3的降低通过抑制其介导的FOXO3 mRNA的稳定性而显著增强肝癌对索拉非尼耐药性，而过表达FOXO3可恢复m6A依赖性的索拉非尼敏感性。因此靶向m6A修饰的潜在调节因子，可以改善对索拉非尼耐药的肝癌的治疗效果，为肝癌的药物治疗提供了一种新的方法。

目前关于m6A修饰与肝癌耐药性的研究尚不完善，治疗效果更有待临床验证。为了研发出更多靶向作用m6A调节蛋白的制剂，还需要我们进一步探索m6A修饰与肝癌耐药机制的关系，以期为肝癌的化学药物治疗提供新策略，延长肝癌晚期患者的生存期，改善治疗效果。

5 小结及展望

肝癌的发生是病毒感染、免疫机制、遗传背景以及环境等多重因素共同作用的结果。目前肝癌的早期诊断主要依靠血清甲胎蛋白(AFP)检测和影像学检查，由于血清AFP特异性不高及影像学检查的局限性，导致早期肝癌诊出率欠佳，大多数患者就诊时往往已处于晚期。且肝脏肿瘤生长速度快、易于转移和侵袭、缺乏有效的治疗手段也是导致大部分患者预后差、5年生存率低的主要原因。因此，提高早期肝癌的诊断效率，促进肝癌靶向治疗药物的研发是我们今后研究的主要方向。上述因子在肝癌组织中均有差异表达，且通过各种不同的途径对m6A修饰水平进行调节，从而不同程度上影响肝癌细胞的增殖、侵袭、转移、耐药及预后，表明了m6A甲基化修饰及其相关因子在肝癌的诊断、恶性程度的判断和预后方面具有一定的潜力。目前针对m6A修饰在肝癌中具体作用机制的研究还处于初期阶段，尚无研究发现m6A甲基化修饰在早期肝癌中的变化程度，因此未来想要将其应用到早期肝癌的诊断中，还需明确m6A甲基化在早期肝癌中的具体变化水平，并可与血清AFP进行联合诊断，以改善单一血清AFP在早期肝癌诊断中效能欠佳的现状，提高早期肝癌的诊断效率。目前手术切除、经肝动脉栓塞化疗(TACE)和化学药物仍是治疗肝癌的主要手段。但手术治疗创伤大、恢复慢，TACE治疗不彻底、易复发等都是导致治疗效果不佳的主要原因。m6A及其调节因子与肝癌进展及耐药性的关系为针对这些因子研发出靶向治疗药物，提高肝癌患者的治疗疗效提供了理论依据。近年来甲基化检测技术的不断发展和进步，越来越多的研究聚焦于RNA甲基化修饰。随着对肝癌发病机制的更进一步研究以及检查和治疗手段的完善，m6A修饰及其调控蛋白有望成为肝癌诊断、治疗及预后判断的新靶标。