刘霞，廖梅香，罗江浩

赣南医学院（赣州 341000）

菊科植物向日葵（Helianthus annuusL.）系一年生草本植物，别名葵花、草天葵、望日莲、太阳花、朝阳葵等[1]。向日葵的种子（葵花籽）中油脂含量丰富，含有超过85%的不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸中又含有近65%的亚油酸[2]，此外葵花籽中还具有葵花籽蛋白和绿原酸等物质。目前我国对向日葵的使用加工仅限于油脂的提取[3]，关于葵花籽中绿原酸的提取却较少提及。绿原酸作为葵花籽发挥药理作用的有效成分之一，具有抑菌消炎、促进凝血、清除体内自由基、维持血糖平衡、预防心脑血管疾病等多种功效[4]。另外，绿原酸还因其抗炎、抗氧化、抑菌和防辐射的药效被广泛用于食品、化妆品和化工等领域[5-7]。正因为绿原酸在各领域上的广泛使用，对绿原酸的提取就显得意义重大。

目前，采用酶法辅助PEG-200超声波提取葵花籽仁中绿原酸的研究尚未见报道。试验以葵花籽仁为原材料，在单因素试验的基础上，利用响应面法设计原理，优化工艺条件，为葵花籽仁绿原酸的深入研究做准备，并为其综合开发利用提供一定的理论参考和技术依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

葵花籽仁，市售；绿原酸标准品，天津一方科技有限公司；纤维素酶（5×104U·g-1），江苏锐阳生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

SPECORD 50 PLUS型紫外分光光谱仪（德国耶拿分析仪器股份公司）；ME104/02型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SHA-C数显水浴恒温振荡器（金坛市城东新瑞仪器厂）；KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；202A-2型电热恒温干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

参照文献[8]绿原酸标准曲线测定方法。精密称取10.16 mg于120 ℃减压干燥至恒重的绿原酸标准品于100 mL容量瓶中，并用体积分数为30% PEG-200定容，摇匀，即得101.6 μg·mL-1的绿原酸标准品溶液。精密量取0，0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 mL该绿原酸标准品溶液，分别置于10 mL容量瓶中，分别加体积分数为30% PEG-200至刻度，摇匀，静置，配制成0，3.12，6.23，9.35，12.47和15.59 μg·mL-1一系列标准溶液。在最大吸收波长329 nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，绿原酸标准品溶液质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程A=0.051C+0.003 9，相关系数R2=0.999 8。

1.2.2 葵花籽仁绿原酸的提取过程

葵花籽仁→烘干→粉碎→过筛→脱脂（用一定比例的石油醚）→溶解（体积分数为30%的PEG-200）→调节pH→酶解（加纤维素酶）→超声提取（50 ℃）→趁热过滤→滤液减压浓缩→定容

4.腹部按摩，从右下腹开始，以轻柔力道做顺时钟方向按摩，每次10～20圈，一天2～3次，可帮助舒缓腹胀感。

1.2.3 绿原酸提取率测定

将上述提取液按一定比例稀释后，按1.2.1的测定方法测定吸光度，并计算绿原酸提取率。

1.2.4 单因素试验

选取酶用量、酶解时间、酶解温度、液固比及超声时间进行单因素试验，研究它们对葵花籽仁绿原酸提取率的影响。

1.2.5 响应面试验设计[9]

试验的水平因素见表1。

表1 响应面试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶用量对绿原酸提取率的影响

由图1可知：当酶用量为0~1.0%时，绿原酸提取率逐步增大；当酶用量为1.0%时，绿原酸的提取率达到最大值3.24%；后续增大酶用量，绿原酸提取率开始下降。这是因为前期随着酶用量的增加，酶与底物接触概率增大，酶解反应速率加快；后续增加酶用量，会导致反应系统中底物浓度相对不够，酶促反应速度下降，因而绿原酸浸出率降低[10]。因此最佳试验条件选择1.0%酶用量。

图1 酶用量对绿原酸提取率的影响

2.1.2 酶解温度对绿原酸提取率的影响

图2 酶解温度对绿原酸提取率的影响

2.1.3 酶解时间对绿原酸提取率的影响

由图3可以看出，随着酶解时间的延长，绿原酸提取率先逐渐增加，当酶解时间为1.5 h时，提取率达到峰值3.34%，之后随着酶解时间的增加，提取率缓缓下降。这是因为绿原酸本身结构的不稳定性，长时间加热或见光的条件将其易氧化分解[11]，因而提取率降低。因此试验将酶解时间定为1.5 h。

图3 酶解时间对绿原酸提取率的影响

2.1.4 液固比对绿原酸提取率的影响

由图4可以看出，在一定范围内液固比越大，绿原酸提取率越高。当液固比为20∶1（mL/g）时，绿原酸提取率可达峰值3.42%，之后绿原酸提取率开始逐步下降。这是因为PEG-200作为非离子型表面活性剂，可明显降低界面张力，增加细胞膜的渗透性；此外PEG与水混合后形成胶束，绿原酸的非极性基团可进入胶束内核被增溶，使绿原酸更易溶于水中。而液固比超过其最佳比后，其他物质也会相应进入胶束内核，占据一定的体积后被增溶[12]，使绿原酸的溶出减少，提取量反而降低。因此选择20∶1（mL/g）为最佳液固比。

图4 液固比对绿原酸提取率的影响

2.1.5 超声时间对绿原酸提取率的影响

由图5可知：超声时间对绿原酸提取率的影响是一个先急速上升后缓缓下降的过程；当在超声时间为30 min时，绿原酸提取率达到峰值3.39%，之后提取率开始下降，因此选择30 min为最佳超声时间。

图5 超声时间对绿原酸提取率的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

响应面中心组合试验方案与结果见表2。应用Design-Expert 8.0.6软件对表2进行回归拟合，得出方差分析表，见表3。

表2 Box-behnken中心组合试验结果

表3 响应面方差分析结果

经过二次回归拟合分析获得葵花籽仁中绿原酸提取率（Y）与酶用量（A）、酶解时间（B）、液固比（C）和超声时间（D）之间的拟合方程：Y=1.345 4+0.295 0A+3.720 0B-0.068 8C-5.000 0E-004D-0.610 0AB+0.093 0AC-5.500 0E-003AD-0.052 0BC+7.000 0E-003BD+1.850 0E-003CD-0.615 0A2-0.845 0B2-3.000 0E-004C2-5.750 0E-004D2。

由表3可知：回归方程的p＜0.01，表明该回归模型达到极显著水平。该拟合模型的相关系数R2=0.966 5，调整系数Radj2=0.933 0，均大于90%，表明回归模型拟合良好，试验误差小，可用于拟合酶法辅助PEG-200提取葵花籽仁中绿原酸的过程。一次项A、B、C、D，交互项AB、AC、BC、CD，二次项A2、B2、D2的p值均小于0.05，表明酶用量、酶解时间、液固比和超声时间对葵花籽仁中绿原酸的提取量均有显著影响，且影响顺序（主→次）为酶解时间＞酶用量＞超声时间＞液固比。交互项AB、AC、BC、CD的p值均小于0.01，表明酶用量与酶解时间、酶用量与液固比、酶解时间与液固比、液固比与超声时间的交互作用对葵花籽仁中绿原酸的提取量均有极其显著影响。

2.2.2 响应面交互作用分析及最佳提取工艺研究

各试验因素间的交互作用对葵花籽仁绿原酸提取率的影响可从响应曲面图直观地观察。由图6可以看出：酶用量与酶解时间、酶用量与液固比对葵花籽仁绿原酸提取率具有最显著的交互作用，表现为响应曲面比较陡峭；酶解时间与液固比、液固比与超声时间交互作用的影响次之，表现为曲面坡度稍平缓。各试验因素间的交互作用对葵花籽仁绿原酸提取率的影响与表3中的方差分析结果一致。

根据Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行优化分析，最佳工艺参数确定为酶用量0.5%、酶解时间1.7 h、液固比15∶1（mL/g）、超声时间32 min。在此工艺条件下进行3次验证试验，实际得到的提取率为3.49%，与预测值3.55%相差较小，相对误差为1.69%，表明该模型可以较好地拟合葵花籽仁绿原酸的提取过程。

2.3 不同提取方法的对比

由表4可知：与超声法相比，酶法联合超声法提取葵花籽仁中绿原酸虽耗时更长，但提取率增加近1倍；与酶法联合回流法相比，提取时间缩短，提取率却增加，这可能与绿原酸在长时间高温条件下发生水解和氧化有关。由此说明酶法联合超声法可显著提高葵花籽仁中绿原酸的得率。

表4 不同提取方法提取葵花籽仁中绿原酸的比较（±s，n=3）

表4 不同提取方法提取葵花籽仁中绿原酸的比较（±s，n=3）

序号 提取方法 提取时间 葵花籽仁绿原酸提取率/%1 酶法联合超声法 134 min 3.49±0.35 2 超声法 30 min 2.03±0.24 3 酶法联合回流法 3.5 h 3.08±0.17

3 讨论与结论

通过响应面分析方法的优化，采用酶法辅助PEG-200提取葵花籽仁中绿原酸的最佳工艺条件为酶解温度50 ℃、酶用量0.5%、酶解时间1.7 h、液固比15∶1（mL/g）、超声时间32 min。在此工艺条件下实际提取率为3.49%，相对误差为1.69%，表明该设计方法对葵花籽仁绿原酸提取工艺的优化具有可行性。该方法与超声法单技术相比，虽耗时更长，但提取率增加近1倍；与酶法联合回流法相比，该方法提取时间缩短，提取率却增加，这可能与绿原酸在长时间高温条件下发生水解和氧化有关。由此说明酶法联合超声法可显著提高葵花籽仁中绿原酸的得率。该研究结果可为葵花籽绿原酸的提取提供一定的参考依据和借鉴作用。