钟昊然，王培莉，郭 佳，王 亨，朱国强，李建基，崔璐莹，董俊升，孟 霞*

(1.扬州大学兽医学院，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009；2.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，扬州 225009)

在1/4的革兰阴性菌中都能发现六型分泌系统(Type VI secretion system, T6SS)的存在[1-2]。ClpV作为T6SS的必需组分，能在ATP的驱动下完成T6SS的回收，为T6SS分泌效应因子提供能量[3]。大肠杆菌(Escherichiacoli，Ecoli)被证实含有3套T6SS，有研究表明T6SS2在侵袭脑微血管内皮细胞的过程中发挥重要作用，且T6SS2也含有核心组分ClpV2[4]。但目前关于ClpV2的生物学特性研究却鲜有报道[5]。

本研究利用Red同源重组，成功构建了TW-XM菌株T6SS2中的clpV2基因突变株，并比较各突变株部分生物学特性的差异，为深入研究ClpV2在APEC致病性的过程中发挥何种作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

菌株APEC TW-XM、DH5α；质粒pKD46、pKD3、pCP20均由扬州大学朱国强教授馈赠。

1.2 主要试剂、仪器

Marker Ⅲ购自北京天根生化科技有限公司；Mueller-Hinton琼脂购自青岛高科园海博生物技术有限公司；常用药敏片购自杭州微生物生物试剂有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据APEC TW-XM菌株已知的clpV2基因序列，设计缺失引物ΔclpV2-Cm-F/ΔclpV2-Cm-R、缺失鉴定引物clpV2-F/clpV2-R及回补引物pBR-clpV2-F/pBR-clpV2-R。引物均由南京擎科生物技术公司合成，序列见表1。

表1 构建clpV2基因突变株的引物序列

1.4 clpV2基因突变株的构建与遗传稳定性试验

按照丁雪燕等[6]的方法，通过Red同源重组构建clpV2基因缺失株。筛选clpV2线性片段与含有pKD46的TW-XM感受态细胞的阳性转化子，以clpV2-F/clpV2-R为引物进行PCR鉴定。随后将pCP20质粒导入一次重组菌中，再次以clpV2-F/clpV2-R为引物进行PCR鉴定。鉴定正确后命名为TW-XM△clpV2。……