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驻颜乳剂凝胶的质量评价及药效考察

2021-11-22李泽福李越胡等慧黄凤婷

中国美容医学 2021年6期
关键词:抗氧化活性抗衰老质量评价

李泽福 李越 胡等慧 黄凤婷

[摘要]目的:制备驻颜乳剂凝胶并对其质量及药效进行考察。方法:以综合评分为响应值,通过Box-Behnken响应面法筛选驻颜乳剂凝胶的制备方法,并对影响驻颜凝胶质量的项目进行了相关测试,通过测定驻颜乳剂凝胶羟自由基、超氧离子自由基、DPPH自由基三者的IC50值考察其体外抗氧化作用,通过测定小鼠皮肤匀浆液中羟脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)与含水率的变化考察驻颜凝胶延缓皮肤衰老的作用。结果:乳剂凝胶的最佳制备工艺为卡波姆用量1.00%、甘油用量15.00%、pH6,且各项试验项目均符合要求;不同浓度的驻颜乳剂凝胶均具有一定程度体外抗氧化能力,与对照组相比,能显著升高小鼠皮肤中SOD活力(P<0.05,P<0.01),降低MDA水平(P<0.05,P<0.01),减少HYP含量(P<0.05,P<0.01)。结论:本驻颜乳剂凝胶符合凝胶局部外用制剂要求,质量稳定可靠,对小鼠皮肤衰老具有延缓的作用,为凝胶剂进一步的研究与开发提供了新思路。

[关键词]乳剂凝胶;质量评价;抗衰老;抗氧化活性

[中图分类号]R339.3+8    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455(2021)06-0158-06

Quality Evaluation and Pharmacodynamic Investigation of Zhuyan Gel

LI Ze-fu1,LI Yue2,HU Deng-hui2,HUANG Feng-ting1

(1. Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510378,Guangdong,China; 2.Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 102488,China)

Abstract: Objective Prepare the Zhuyan emulsion gel and investiga its quality and efficacy. Methods Taking the comprehensive score as the response value, the preparation method of the resident facial emulsion gel was screened by the Box-Behnken response surface method, and related tests were conducted on the items affecting the quality of the resident facial gel. the anti-oxidation effect of in-vivo emulsion was determined by measuring the IC50 value of hydroxy hydroxyl radical, superoxide ion radical and DPPH radical, and by measuring superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), The changes of hydroxyproline (HYP) and water content were used to investigate the anti-aging effect of Zhuzhan gel. Results The best preparation process of emulsion gel is carbomer dosage 1.00%, glycerol dosage 15.00%, Ph 6, and all test items meet the requirements,and pH, viscosity, moisturizing rate, microbial limit, content and other test items all meet the requirements, and different concentrations of resident facial emulsion gels have a certain degree of antioxidant capacity in vitro,can significantly increase the SOD activity in mouse skin (P<0.05, P<0.01), reduce MDA level (P<0.05,P<0.01),reduce HYP content (P<0.05,P<0.01). Conclusion The preparation technology of this gel is simple, conforming to the main index requirements of gel topical preparation, stable and reliable quality, and has a retarded effect on skin aging in mice. It provides a new idea for further research and development of gel.

Key words: Emulsion gel; quality evaluation; anti aging; antioxidant activity

機体衰老是所有生物体不可逆的自然生命现象,是指生物发育成熟后,随着机体年龄不断增加,机体的各个器官组织以及器官结构发生长期退行性结构变化而逐渐产生的一种不可逆过程,其中尤以人体外在皮肤结构改变最为明显。皮肤衰老的主要表现是皮肤弹性的减弱、各种皱纹色斑的不断形成、水分的随之减少[1-3]。现有医学理论研究认为,大部分肌肤产生色斑老化的现象与机体自由基的产生被破坏有关。当机体皮肤内的自由基被严重破坏,皮肤深层细胞的自体免疫能力也将随之迅速下降,从而对皮肤机体功能造成严重伤害,引起衰老[4-5]。与此同时,这些自由基又可使某些脂类结合形成过氧化后的脂质,导致MDA含量有所升高,过氧化后的脂质又进一步与其交联结合形成某些蛋白质、脂质及某些核酸等然后逐渐沉聚于皮肤细胞内部,从而逐渐导致人体皮肤中的组织逐渐呈现衰老现象。皮肤组织中的某些胶原蛋白性质也同样会发生变化而逐渐引起核酸含量有所减少,羟脯氨酸(HYP)作为最能反映皮肤状态的一种氨基酸,其含量也同样会有所降低。另外,超氧化物歧化酶(SOD)在人体中的活力也会因年龄段不同而发生改变,机体越衰老,其活力越差[6-9]。

本研究中采用的驻颜方,由人参、茶叶、黄芪、当归等中药组成,来源于广州中医药大学第三附属医院的临床经验方,具有提高皮肤含水量、延缓衰老等作用。但原有临床经验方为通过煎煮法制得的洗剂,具有操作不便,不容易长时间保存,需现配现用,与皮肤作用时间短等缺点,而微乳凝胶为新型经皮给药制剂,可以克服上述缺点,生物利用度高。因此,本研究将驻颜方制备为乳剂凝胶剂,利用乳剂凝胶剂优良的延展性、载药量大、释药性能好和无毒无刺激性的优点,考察不同浓度乳剂凝胶剂对小鼠皮肤的抗衰老作用,为更好服务于临床奠定研究基础。

1  仪器和试剂

1.1 仪器:UV-2450PC 紫外可见分光光度测量计(中国岛津机械有限公司苏州海外机械厂),JA1004 电子分析天平(中国上海精密科学仪器有限公司),组织匀浆机(中国杭州浙西机械厂),5417R 冷冻离心机(Eppendorf公司),R201 旋转蒸发仪(河南太康科教仪器设备有限公司)等。

1.2 试剂:乳剂凝胶(实验室自制),总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,批号 20170815),丙二醛(Malondialdehyde,MDA;批号:20170927)、总超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD;批号:20170815);羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP;批号:20170824)试剂盒均购于南京建成生物工程所;其余各类试剂均为分析纯级别,配制用水均为双蒸水。

1.3 动物:SPF级昆明种小鼠,雌雄各半(3月龄和12月龄,合格证号 SCXK(京)2016-0002,购于北京斯贝福实验动物科技有限公司)。

2  方法和结果

2.1 乳剂的制备:处方量中药材,粉碎100目,10倍95%乙醇冷浸2次,分别24h和48h,减压浓缩干燥。称取浸膏粉1g,加2ml95%乙醇超声溶解、分散,依次加入2ml甘油、6ml油酸、1mlTween-80混合均匀,缓慢加入处方量蒸馏水至10ml,搅拌形成初乳,探头超声匀化乳剂。

2.2 乳剂凝胶的制备:称取一定量卡波姆,用适量甘油润湿,加蒸馏水至100g,搅拌均匀,静置使其充分溶胀。将2.1方法下的微乳缓慢滴加至已溶胀好的凝胶基质中,继续搅拌,滴加三乙醇胺调节pH,并加蒸馏水至一定体积,搅匀,于4 ℃密闭贮存,即得乳剂凝胶。

2.3 乳剂凝胶的处方优化

2.3.1 乳剂凝胶成形评分标准:参照文献[10-11],以乳剂凝胶的外观、延展性、均匀度、离心性的综合评分为考察指标,筛选其制备的最佳工艺,具体评分标准见表1。

2.3.2 Box-Behnken响应面法实验设计:本实验参考相关文献[12],根据前期单因素筛选及预实验结果,利用BBC设计原理,选取卡波姆用量A、甘油用量B、Ph C 3个自变量作为考察因素,以综合平分为响应值,设计三因素三水平的响应面优化实验。利用Design-Expert软件进行响应面分析,确定乳剂凝胶制备的最佳工艺。见表2。

2.3.3 模型拟合:采用Design-Expert进行数据分析,以因变量Y对三个自变量进行模型拟合,并通过相关系数(R2)对拟合模型进行评价,通过比较各拟合方程的拟合度,得到二次多项式回归方程Y=91.60-8.37×A+5.5×B+1.38×C+7.00×A×B-2.75×A×C+1.00×B×C-9.93×A2-8.18×B2-20.40×C2,R2=0.9548,P<0.01,F=16.43,表明模型差异性极显著;失拟项P=0.1742>0.01,差异不显著,说明该模型实验误差小,拟合度和可信度均可靠,可以用此模型对乳剂凝胶的制备工藝进行分析和预测。

2.3.4 响应面优化分析:根据拟合方程,通过Design-Expert V8.0.6.1软件绘制评价指综合评分随各因素变化的等高线图和响应面图。在一定范围内,随着卡波姆用量、甘油用量、pH的增加,综合评分先增大后减小;其中卡波姆用量对综合评分影响最为显著,甘油用量次之,pH最不显著;另外,卡波姆用量与甘油用量的交互作用最为明显,对综合评分影响最为显著。见表3~4。

2.3.5 制备工艺优化结果及验证:根据回归模型分析可知,乳剂凝胶的最佳制备工艺为:卡波姆用量0.82%、甘油用量15.92%、pH5.80,按照优化的处方剂量,结合实际操作情况,各因素值保留为整数,即卡波姆用量1.00%、甘油用量15.00%、pH6。在此条件下进行三次平行实验,综合评分平均值为94.21与理论值93.68比较接近,且RSD<5%。说明该回归方程与实际情况拟合较好,该最佳工艺切实可行,可操作性强。

2.4 驻颜乳剂凝胶的质量评价

2.4.1 外观性状:粘稠度适中、涂展性良好、易渗透吸收、均匀细腻、无油腻粘滞感、肤感舒适、无刺激性的半固体凝胶。

2.4.2 pH值测定:3个批次驻颜乳剂凝胶的pH值分别为5.87、5.94、6.21,符合皮肤局部外用制剂对pH值的要求。

2.4.3 黏度的测定:3个批次驻颜乳剂凝胶室温下数字粘度计(4号转子,转速为12r/min)测得黏度分别为48 703、48 791、48 688 mPa·s。

2.4.4 保湿率的测定:3个批次驻颜乳剂凝胶样品干燥至恒重后精密称定(M0);将驻颜乳剂凝胶均匀涂布于载玻片上,然后将该载玻片放置于室温(25±1)℃、相对湿度为(43.16±0.39%)的恒温、恒湿密闭干燥器中,精密称量放置24h后的样品质量(Mt),根据公式计算样品保湿率(保湿率=M0/Mt),结果3批驻颜乳剂凝胶经放置24h后的保湿率分别为91.88%、92.67%、93.05%、表明驻颜乳剂凝胶保湿性良好,有利于在皮肤上涂展。

2.5 驻颜乳剂凝胶体外抗氧化作用测定[13]

2.5.1 不同浓度乳剂凝胶待测液的制备:分别取1、2、3、4、5mg乳剂凝胶于含5ml纯水的具塞试管中,搅拌、混匀,即得0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml不同浓度乳剂凝胶待测液。

2.5.2 羟自由基清除能力的测定:采用碱性水杨酸比色法,取不同含量浓度的乳剂凝胶待测液,分别依次均匀加入FeSO4溶液、H2O2溶液以及碱性水杨酸-乙醇溶液。摇匀,37℃水浴0.5h,室温下冷却,510nm下测定吸光值记为A1,以双蒸水作参比,不同浓度乳剂凝胶待测液重复测定三次取平均值,记为A0。根据A0与A1计算不同浓度乳剂凝胶羟自由基清除率。公式如下:

羟自由基清除率(%)=(A0- A1)/A0×100%

式中:A1为待测液在510nm下的吸光值;A0为以H2O代替待测液在510nm下的吸光值。

2.5.3 超氧离子自由基清除能力的测定:取不同浓度的乳剂凝胶待测液,加入Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2),30℃的水浴20min,反应结束,冷却至室温,再次加入等量邻苯三酚溶液,摇匀,继续充分反应3min,加入浓盐酸终止反应,于320nm测定吸光值A1,以双蒸水作参比,每个浓度测三次取平均值,即为A0。根据A0与A1计算不同浓度乳剂凝胶超氧自由基清除率。公式如下:

超氧自由基清除率(%)=(A0- A1)/A0×100%

式中:A1为待测液在320nm下的吸光值;A0为以H2O代替待测液在320nm下的吸光值。

2.5.4 DPPH自由基清除能力的測定:分别于DPPH乙醇溶液加入等体积不同浓度的乳剂凝胶待测液,两者迅速摇匀,置于室温条件下且避光反应30min,反应结束,517nm下测吸光值A1,以双蒸水作参比,每个浓度重复检测三次取平均值,即为A0。根据A0与A1计算不同浓度乳剂凝胶DPPH清除率。公式如下:

DPPH清除率(%)=(A0- A1)/A0×100%

式中:A1为待测液在517nm下的吸光值;A0为以H2O代替待测液在517nm下的吸光值。

由表5可知,不同浓度驻颜乳剂凝胶均具有一定程度清除羟基自由基、超氧离子自由基、DPPH自由基的能力,且表现出一定的剂量依赖关系,随着浓度增加,其清除能力均有所增强。结合表6中的半数有效抑制浓度(IC50)分析可知,驻颜乳剂凝胶对超氧自由基清除能力最强。

2.6 驻颜乳剂凝胶对小鼠皮肤中SOD、MDA、HYP的影响

2.6.1 动物分组与给药:将12月龄小鼠随机分为4组,每组10只。另将10只3月龄小鼠作为年轻组对照。其中对照组涂抹空白乳剂凝胶,给药组小鼠分别涂抹不同浓度的乳剂凝胶剂1mm厚度(涂抹区域2cm2,去毛),早晚各一次,共3 个月。

2.6.2 皮肤匀浆液的制备:用手术剪剪取各组小鼠背部皮肤0.5g,除去脂肪组织,冲洗干净后置于10mL中EP管中,加入5mL生理盐水,手术剪预处理剪碎,然后匀浆机处理,制得质量分数为10%的皮肤组织匀浆液。取适量制备的匀浆液涂片,显微镜下观察小鼠皮肤中组织细胞的破碎情况。并测定其中的羟脯氨酸(HYP)含量、丙二醛(MDA)以及超氧化歧化酶(SOD),分析结果。

2.6.3 HYP的测定:剪取背部皮肤组织块0.5g左右,经漂洗乙醚脱脂后80℃烘干,精密称取20mg样品,加2ml 6mol/L HCl混匀后密塞,于125℃酸解3h以上,NaOH调至pH为6,加水定容至10.0ml,取0.1ml水解液按氯胺T氧化[14-15]测定HYP 的浓度。见表7。

2.6.4 MDA含量测定:取上述10%的皮肤匀浆液适量,离心后取上清液测定。测定方法严格按试剂盒说明进行。见表8。

2.6.5 SOD活力测定:取皮肤匀浆液2.0ml,加0.5ml 95%乙醇,4 000r/min离心5min,取上清液,用改进的邻苯三酚自氧化法[16]测定。见表9。

由表7~9可知,涂抹不同剂量的驻颜乳剂凝胶后,各组小鼠皮肤中的SOD、MDA以及HYP与均具统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与对照组相比,实验组小鼠皮肤的SOD活性显著升高,MDA水平显著降低,HYP的含量显著增加。说明驻颜乳剂凝胶能增强了小鼠清除自由基和抗氧化的能力,从而证明不同剂量驻颜凝胶均能有效地延缓小鼠皮肤衰老,且延缓衰老的效果和制剂的剂量关系呈正相关,即随着剂量增加效果增强。

2.7 小鼠皮肤含水率的测定:选取适量(2cm×2cm)小鼠背部皮肤,脱毛处理,手术剪取,电子太平立即测定,精密称取湿重,干燥至恒重后精密称取干重,计算含水率。皮肤含水率=(湿重-干重)/湿重×100%。见表10。

皮肤含水率实验表明,不同剂量驻颜乳剂凝胶涂抹后,小鼠皮肤的含水率与对照组均有显著增加(P<0.05,P<0.01),表明驻颜凝胶可以升高皮肤的含水量,对延缓皮肤衰老有良好的促进作用。

3  讨论

皮肤衰老是一种自然规律,是人类及任何自然生物都必须需要经过的一个阶段,随着人们年龄的增大,皮肤老化的表现也将越为明显。通常情况,引起人体皮肤老化的决定性因素主要分为两种,即皮肤内源性因素和皮肤外源性因素:其中内源性的因素主要是指直接影响人体的皮肤自然生理老化,外源性的因素主要是指由于外界的因素作用引起的皮肤老化,主要为光损伤,而导致皮肤衰老的内源性和外源性因素之间却有互相的影响[17]。目前,自由基的学说被广泛认为一直是导致皮肤衰老的重要决定性因素[18],随着皮肤和机体的衰老,体内的抗氧化物质和酶类逐渐减少,产生大量的过氧化自由基,使得机体自由基平衡受到打乱,过量的氧化自由基通过皮肤的过氧化作用使得皮肤表现为粗糙无光、弹性功能减退及皱纹等。

SOD是存在于机体的一种主要的保护性氨基酸酶,具有特殊的皮肤生理活性。在正常的生理条件下,SOD含量相比于损伤皮肤偏高,可以有效免除自由基的损伤和破坏,清除新陈代谢反应代谢过程中可能产生的有害物质,防止这些有害物质活性氧的大量产生和积累,保护细胞膜免受毒害,恢复正常的抗氧化和新陈代谢,延缓皮肤衰老,其活性含量的高低决定机体抗氧化能力强弱[19]。MDA是自由基和脂质过氧化代谢反应的最终产物,其含量的变化直接反映自由基的浓度变化以及机体脂质过氧化的损伤程度,在衰老皮肤中含量偏高,也可以准确地用来衡量细胞自由基的抗氧化和损伤程度[20]。HYP是一种胶原蛋白特有的氨基酸,在皮肤中含量很高,当胶原蛋白的合成受到干扰时,HYP的产生会减少,最终导致胶原纤维合成受损[21]。因此,通过改变三者的含量,可以在一定程度上反映出皮肤的老化状态。

中药经皮给药有着悠久的历史,其是指在中医药理论的指导下,将中药饮片或中药复方经适宜的提取、分离、纯化所得的有效成分、有效部位或提取物与适宜的基质制成外用制剂通过皮肤敷贴给药,经皮吸收发挥局部或者全身治疗作用。现如今,临床上经皮给药主要以软膏剂、贴剂为主,但这传统剂型易造成涂布不均、污染衣物,有的还具有易挥发的缺点,具有一定的局限性。而凝胶剂属于透明半固体制剂,和传统制剂相比,更加易于涂抹和吸收,且能长时间与皮肤黏附,生物相容性良好。本研究选取卡波姆为基质制备驻颜乳剂凝胶,其具有释药快、易涂展等优点,尤其对皮肤和黏膜无刺激性,更加适合作为一种保护性制剂延缓皮肤衰老。

驻颜乳剂凝胶属纯中药制剂,主要由人参、茶叶、黄芪、当归等药材组成,其制备方法简便,可重复性强,其主要过程为将乙醇提取法所得的中药提取物物制备成乳剂,再将乳剂与凝胶混匀,通过制备乳剂所形成的凝胶剂,具有乳剂和凝胶的双重优势,既能增加载药量,又能提高黏附性,更有利于药物的释放和吸收。且方中中药以补气血为主,符合中医理论治疗皮肤老化病症。而现代药理学认为人参、黄芪、当归等药材均具有一定程度的抗氧化能力,所以能够延缓机体衰老的速度。人参中人参皂苷可以明显地提高小鼠皮肤中HYP的含量,延缓小鼠皮肤衰老,人参多糖可通过提高小鼠体内抗氧化酶的水平,进而产生抗氧化作用;黄芪中含有的有效物质黄芪甲苷、黄芪多糖以及其他黃酮类物质,均有一定的抗衰老作用,能够有效提升小鼠机体抗氧化物质SOD的活性,促进脂质代谢,增强表皮细胞内自身氧化酶系的活力,延长表皮细胞寿命[22-23];当归中的当归多糖能有效提高机体抗自由基对膜结构损伤的能力,减少自由基对生物膜大分子的损伤和攻击,具有清除自由基作用,除此之外,当归提取物还有一定美白功效,在清除自由基的同时还可以清除黑色素[24];茶叶作为护肤品的应用历史悠久,其中茶多酚具有显著的抗氧化作用且能抑制色斑的形成[25]。由此可见,驻颜乳剂凝胶中的主要中药及其所含有效成分均有较强的提高机体抗自由基损伤及增加皮肤胶原纤维和胶原蛋白的正常代谢能力,结合实验结果与现代药理研究可知,该驻颜乳剂凝胶延缓皮肤衰老可能与清除自由基和增强机体免疫力这两种途径有关,其延缓衰老的作用是中药多组分相互作用的结果,体现了中药多靶点的治疗优点。

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[收稿日期]2020-05-08

本文引用格式: 李泽福,李越,胡等慧,等.驻颜乳剂凝胶的质量评价及药效考察[J].中国美容医学,2021,30(6):158-163.

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