仲建锋 李兴奎 徐重新 张霄 刘贤金

（1. 江苏省食品质量安全重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地 农业农村部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室 江苏省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，南京 210014；2. 郑州职业技术学院，郑州 450121）

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种广泛存在于各类环境中的昆虫病原菌，对多种农业害虫具有杀虫活性［1］。Cry1B是Bt Cry毒素的一种，其对鳞翅目昆虫的靶标位点包括中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）上的氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）、钙粘蛋白（cadherin）［2-3］， 以 及 ABC 转 运 蛋 白［4］等。APN属于锌结合金属蛋白酶家族蛋白，它的碳端结合部位富含N-乙酰氨半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc），这些区域是Cry毒素的结合位点［5］。烟芽夜蛾（Heliothis virescens）的170 kD的APN可与Cry1Aa、Cry1Ab 和 Cry1Ac结合［6］。卷叶蛾（Epiphyas postvittana）BBMV上的120 kD的APN可与Cry1Ac和Cry1Ba结合［7］。我们前期研究发现Cry1B抗独特型（anti-idiotypic，anti-Id）单链抗体（single chain fragment variable，scFv）C7可以模拟Cry1B的结构和功能［8］，因此推测C7与昆虫BBMV上的APN可能存在结合关系。但是C7的结合和生物活性跟原毒素Cry1B相比有差距，需要改进提升。

单链抗体由重链可变区（heavy chain variable，VH）和轻链可变区（light chain variable，VL）通过一条单一肽链（linker）组成，大小为完整抗体分子的1/6，制备流程较简单，易进行分子改造［9-10］。然而，基因工程抗体一般存在亲和力低等问题，以计算机模拟为基础的定点突变可以预测分子间结合区域并确定关键氨基酸残基［11］，关键氨基酸的有利突变可以提高抗体的亲和力，在体外通过定点突变等基因工程手段可以构建限定性突变抗体库，进而筛选到高亲和力抗体［12］。Barderas等［13］在研究人类抗胃泌素TA4 scFv亲和力成熟的过程中，在限定性突变的基础上采取定点突变等方法，最终得到将TA4的亲和力提高了454倍的突变scFv。……