杜孟茹 张丽华 吴晓梅 刘志红 谢红浪

系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及多个组织和器官的自身免疫疾病,狼疮性肾炎(LN)是SLE常见的并发症之一。免疫复合物沉积,补体系统、免疫细胞、细胞因子的变化及基因调控异常等因素共同导致LN的发生发展[1]。T细胞亚群的失衡包括Th1细胞、Th2细胞等都可影响LN的进展[2]。“双阴性”(double negative,DN)-T细胞是外周血中表达αβT细胞受体(TCR)但缺乏CD4、CD8和自然杀伤(NK)细胞标记的T细胞[3],约占正常人外周血CD3+T淋巴细胞的1%～3%[4],而在自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)、SLE、干燥综合征等自身免疫疾病中会显著扩增。El-Sayed等[5]发现SLE患者DN-T细胞与疾病活动相关,胡伟等[6]发现SLE患者外周血中DN-T细胞可分泌多种细胞因子,但相关研究和纳入研究的病例数均相对较少。因此,本研究进一步分析LN患者外周血DN-T细胞比例与疾病活动和预后的关联,为LN的疾病活动监测提供新途径。

对象和方法

研究对象回顾性分析2010年1月至2017年12月于国家肾脏疾病临床医学研究中心首次住院治疗的LN患者。纳入标准:(1)符合1997年美国风湿病学会(ACR)修订的SLE诊断标准[7],并伴有肾脏损害的临床表现者。(2)在我院行肾活检者。排除标准:(1)合并严重活动性感染、结核病等;(2)合并原发性心、肝等器质性病变以及造血系统疾病;(3)治疗1年时失访或检验项目不全(图1)。

图1 研究对象筛选流程

临床资料收集患者性别,肾活检年龄、SLE病程、肾脏损害病程、肾外器官受累情况等,使用SLE疾病活动性指数(SLE-DAI)对疾病活动评分。

研究指标收集肾活检及治疗1年时尿蛋白定量、尿沉渣红细胞计数、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖甘酶(NAG)、视黄醇结合蛋白(RBP); 血红蛋白(Hb)、白细胞计数(WBC)、淋巴细胞计数、血小板计数(PLT)、血清白蛋白(Alb) 、血清肌酐(SCr)、尿酸、总胆固醇、三酰甘油、抗双链DNA、补体C3、补体C4、抗C1q抗体。采用流式细胞仪法检测新鲜EDTA抗凝外周血中不同淋巴细胞亚群[外周血CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、调节性T细胞(Treg)],采用双平台法计算不同淋巴细胞亚群的细胞数。

DN-T细胞数量(个/μl)=CD3+T淋巴细胞计数-CD4+T淋巴细胞计数-CD8+T淋巴细胞计数

DN-T比例(%)=DN-T细胞计数/CD3+T淋巴细胞计数×100%

病理资料所有患者均行肾脏穿刺病理检查,常规行光镜、免疫荧光及电镜染色。病理切片按2003年国际肾脏病学会/肾脏病理学会(INS/RPS2003)分型方案进行分型[8]。对多种病理学征象采用半定量计数,进行活动性指数(AI)及慢性指数(CI)评分。

治疗方案结合患者的疾病特征及肾活检病理类型选择治疗方案,包括甲泼尼龙(MP)冲击,口服激素、他克莫司(FK506)、吗替麦考酚酯(MMF)及MMF联合FK506,和静脉环磷酰胺等,部分患者采用双重滤过血浆置换(DFPP)或血浆置换。

主要疗效指标及相关定义本研究主要随访治疗1年时在我院复查的患者,以面对面形式访问患者,观察随访1年时疗效。完全缓解(CR):尿蛋白定量<0.4 g/24h,无活动性尿沉渣,SCr正常或上升不超过基础值15%,Alb≥35 g/L;部分缓解(PR): 尿蛋白定量下降至基线50%以下,且<3g/d,Alb≥30 g/L,SCr正常或上升不超过基础值15%。未缓解(NR):不符合PR或CR标准。随访截止2020-12-31,随访终点定义为进入终末期肾病(ESRD)[根据CKD-EPI公式估算的肾小球滤过率(eGFR)<15 ml/(min·1.73 m2)或接受肾脏替代治疗3个月以上]或死亡。

统计学方法本研究使用《IBM SPSS 21.0》软件对数据进行统计学分析。以单样本Kolmogorov-SmirnovZ检验对计量资料进行正态性检验。计量资料若符合正态分布,以均数±标准差做描述性分析,两组间比较应用两独立样本t检验,相关性使用 Pearson 相关分析;若不符合正态分布,以中位数(四分位数间距)做描述性分析,两组间比较应用Mann-Whitney U检验,相关性使用 Spearman 相关分析。相关系数r的绝对值>0.8认为两者强相关，0.5～0.8为中等相关，若<0.3则认为基本无相关。计数资料以百分率表示,组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验;两配对样本比较采用Wilcoxon符号秩检验。肾累积生存曲线应用Kaplan-Meier曲线分析及Log-Rank检验。单因素分析采用COX回归分析,将结果中P<0.1的变量进入多因素COX回归模型,分析影响不良预后的危险因素。检验均采用双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

基线资料275例LN患者中男性43例(15.6%),女性232例(84.4%),中位年龄27(21,37)岁。所有患者DN-T细胞比例为5.11%±3.58%,范围为0～23.49%。194例(70.5%)患者DN-T细胞比例>3%。根据DN-T细胞比例中位数4.60%,将患者分为DN-T细胞低比例组与DN-T细胞高比例组两组。两组患者肾外器官受累情况如累及血液、皮肤、关节、神经等无差异,DN-T细胞高比例组的年龄更小、SLE和LN病程更短、SLE-DAI评分更高,淋巴细胞比例、尿酸、血钾水平、抗C1q抗体等指标明显高于DN-T细胞低比例组,年龄、补体C3、补体C4明显低于DN-T细胞低比例组。两组间WBC、PLT、Hb、Alb、SCr、尿RBC、尿蛋白定量等无统计学差异(表1)。

表1 两组LN患者基线资料和疗效比较

两组肾小球病理类型分布无差异。与DN-T细胞低比例组相比,高比例组患者肾脏病变的CI、球性硬化和新月体比例更低(P<0.05),毛细血管袢血栓发生率更高(P<0.05)(表2)。

表2 275例LN患者病理特征比较

治疗与疗效两组患者诱导期免疫抑制剂治疗无差异(表3)。随访1年时,81例患者CR(29.5%),104例患者PR(37.8%),90例患者NR(32.7%),两组患者的治疗效果无差异(χ2=2.425,P=0.297)(表1)。

表3 两组诱导治疗方案资料[n(%)]

DN-T比例与疾病活动和疗效的关系基线时DN-T细胞百分比与SLE-DAI评分(r=0.203,P=0.001)、抗C1q抗体滴度(r=0.232,P<0.001),Plt(r=-0.161,P=0.007)、补体C3(r=-0.171,P=0.004)、补体C4(r=-0.152,P=0.012)等指标无显著线性相关关系。

对比基线资料发现,缓解组与未缓解组的尿RBC计数、抗dsDNA阳性比例及补体C3、补体C4、AI、CI、球性硬化比例、节段硬化比例、新月体比例及袢坏死等有统计学差异(P<0.05),两组基线DN-T细胞比例无差异(P=0.872)。治疗1年后,缓解组DN-T细胞比例较基线时显著下降(P=0.001),而未缓解组治疗前后DN-T细胞比例无差异,治疗1年后的缓解组DN-T细胞比例低于未缓解组,但无统计学差异(图2)。

图2 治疗前、后“双阴性”(DN)-T细胞比例对比

肾脏存活远期预后及影响因素中位随访时间62(48,88)月,18例患者进入ESRD,与DN-T细胞低比例组相比,高比例组患者的肾存活率较低,但无统计学差异(P=0.365),而治疗1年后未缓解组患者的肾存活率更低(P<0.001)(图3)。COX单因素分析显示男性、肾脏损害病程长、Alb低、BUN高、SCr高、低补体C4、低Treg、肾脏的球性硬化、节段硬化比例高是影响患者肾脏预后的风险因素。将上述P<0.1的变量纳入多因素COX回归模型,结果显示男性、Treg<23个/μl、肾脏球性硬化>10%、节段硬化>10%是影响患者进入ESRD的独立危险因素(表4)。

图3 LN患者预后DN-T细胞:“双阴性”T细胞;LN:狼疮性肾炎;A:基线DN-T细胞比例<4.6%组与DN-T细胞比例≥4.6%组患者肾存活曲线对比;B:治疗1年时缓解组与未缓解组肾存活曲线对比

表4 影响LN患者肾脏预后的危险因素

讨 论

DN-T细胞是近年来研究发现的一类新的Treg亚群,但其在LN患者外周血中的表达及在疾病进展中作用尚不明确。本研究主要以DN-T细胞/CD3+T细胞即DN-T细胞比例的中位数分为两组,结果显示高DN-T细胞比例组疾病活动评分更高,肾脏的慢性损害程度低。随访1年时,缓解组患者较其活动期时的DN-T细胞比例显著降低。

研究认为,DN-T细胞可能在胸腺细胞发育过程中逃避了阴性选择后在外周血中活化、增殖[9],或直接源自外周血中的CD4+[10]或CD8+T细胞[11-12]。通常认为,健康人外周血DN-T细胞比例很低(约占人CD3+T淋巴细胞的1%～3%)[4],但在自身免疫疾病炎症的刺激下会显著上升。El-Sayed等[5]的研究中约有85%的SLE患者的DN-T细胞水平升高,我们也发现70.5%的LN患者的外周血中DN-T细胞比例升高(>3%)。Alexande等[13]发现,随着疾病进展SLE患者DN-T细胞数量增加,并在LN中起重要作用。动物实验研究显示,在干扰素α(IFN-α)[14]、白细胞介素(IL)-6和IL-23[15-16]的刺激下,DN-T细胞可在浸润器官中显著扩增,分泌大量的IFN-γ、IL-17、IL-4等细胞因子,并降低IL-2的水平,引发LN及皮肤损伤等。这些都可能与活动期LN患者DN-T细胞比例更高有关。

DN-T细胞在SLE患者肾脏中浸润,分泌促炎因子,激活其他免疫细胞并诱导自身抗体产生,从而造成肾脏损害[17]。Lai等[18]发现SLE患者体内雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激活可促进DN-T细胞产生IL-4, 从而激活B细胞、产生dsDNA 抗体,进一步造成组织损伤。研究发现,SLE患者在西罗莫司(mTOR抑制剂)治疗后,DN-T细胞产生的IL-4和IL-17明显减少[18-19],Treg计数较前增加,有效地改善了SLE疾病活动。本研究发现大部分患者经治疗获得缓解后,DN-T细胞比例较前显著下降(P=0.018)。有研究发现,DN-T细胞可能与类固醇持续时间和累积剂量、MMF累积剂量之间存在负相关[5];但也有研究认为,DN-T细胞与细胞毒性药物使用无关,在治疗8个月内保持稳定[20]。我们认为DN-T细胞的影响因素可能存在异质性或特殊基因背景,部分患者在治疗后DN-T细胞比例无明显下降可能与之相关。

最近的几项研究发现MRL/lpr狼疮小鼠在接受11a-1[一种有效、可逆和特异的SHP2抑制剂(SHP2:一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶)][21]、四硫化四砷(As4S4)[22]、羟甲香豆素(4-Methylumbelliferone,4-MU)(透明质酸抑制剂)[23]、隐丹参酮(cryptotanshinone,CTS)(STAT3抑制剂,STAT3:信号转导和转录激活因子3)[24]治疗后,DN-T细胞数量明显降低,炎症细胞因子如IL-17,IFN-γ等也较前减少,并抑制了靶器官的组织损伤,这进一步说明了DN-T细胞在狼疮和肾损伤中的重要作用,同时也预示着DN-T细胞或许是SLE潜在的治疗靶点。

本研究尚存在一定局限性:(1)单中心样本的回顾性研究,缺少对照组;(2)因患者失访或检验资料不全被排除的病例较多,最后入选小部分病例所得结果可能存在偏差;(3)由于时间、研究条件的限制以及研究目的的需要,我们只将患者以DN-T细胞比例中位数为界值分为两组,未观察不同治疗方案对DN-T细胞比例的影响。(4)DN-T细胞比例较低的患者病程较长,可能跟既往接受免疫抑制治疗有关,但本文没有分析既往治疗与基线DN-T细胞计数的关联。

小结:LN患者的外周血中DN-T细胞百分比高于正常水平,可能在整体水平反应患者的疾病活动性,或许可作为监测疾病活动及疗效的候选指标,但有待进一步扩大样本研究及前瞻性研究证实。