反相高效液相色谱法同时测定鼻咽清颗粒中龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷含量*

2021-11-19张丽娟蓝献泉郑锦坤阙伟祺李庆德

中国药业 2021年21期

张丽娟，蓝献泉，郑锦坤，阙伟祺，李庆德，朱燕

（1.粤北人民医院，广东韶关 512026； 2.广东省韶关市食品药品检验所，广东韶关 512028）

鼻咽清颗粒为粤北人民医院的特色制剂（粤药制字Z20071539），由重楼、夏枯草、野菊花、龙胆、两面针、蛇泡勒、太子参、苍耳子8味中药组方，用于治疗鼻咽部慢性炎症及鼻咽癌放射治疗后分泌物增多，可抑制鼻咽癌的生长，且具有放疗增敏作用[1]。方中龙胆具有清热燥湿、泻肝胆火等功效，有效成分为龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、当药苷等环烯醚萜苷类化合物。龙胆苦苷具有良好的抗氧化应激、抗肝损伤、抗肿瘤等药理作用[2-3]，含量高，与龙胆药材药理作用一致，常作为评价龙胆药材质量的重要指标。夏枯草性寒，味辛、苦，归肝胆经，善清肝火、散郁结，主要活性成分迷迭香酸为典型的酚酸类物质，具有较强的抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性[4-5]。野菊花清热解毒，主要活性成分蒙花苷具有抗炎、免疫、保肝、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用[6]。现行质量标准为夏枯草和两面针的薄层鉴别，未对组方成分进行含量测定，不利于质量控制。本研究中参考文献[7-13]，采用反相高效液相色谱双波长法同时测定鼻咽清颗粒中龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷3种活性成分的含量，并确定其含量限度，为进一步完善该制剂的标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；MSA225S-ICE-DU型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）；AS10200ADT型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，功率为300W，频率为40kHz）。

1.2 试药

鼻咽清颗粒（粤北人民医院医院制剂，批号分别为20190325，20191227，20200520）；龙胆苦苷对照品（批号为110770-201918，含量以97.1%计），迷迭香酸对照品（批号为111871-201706，含量以90.05%计），蒙花苷对照品（批号为111528-201509，含量以97.50%计），均购自中国食品药品检定研究院。龙胆（批号为20200524），两面针（批号为15042806），野菊花（批号为20200501），苍耳子（批号为20180603），均购自湖南安健中药饮片有限责任公司；重楼（樟树市庆仁中药饮片有限公司，批号为1406248）；夏枯草（安徽鑫泰药业有限公司，批号为200701）；蛇泡勒（广州至信中药饮片有限公司，批号为200401）；太子参（江西致和堂中药饮片有限公司，批号为200701）；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ACE Excel C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min时10%A，5～10 min时10%A→15%A，10～13 min时15%A，13～18 min时15%A→22%A，18～20 min时22%A，20～30 min时22%A→30%A，30～40 min时30%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：274 nm（0～20 min时龙胆苦苷），334 nm（20～40 min时迷迭香酸和蒙花苷）；柱温：30℃；进样量：10μL。各组分与相邻峰之间分离度均大于1.5，龙胆苦苷、迷迭香酸、蒙花苷的理论板数均不低于10 000。

2.2 溶液制备

取龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.529 2，0.100 3，0.227 8 mg/mL的混合对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mL，置25mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得混合对照品溶液。取样品2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，室温超声处理30 min后取出，放冷，补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。按处方比例及工艺分别制备不含龙胆、夏枯草和野菊花的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL，按2.1项下色谱条件进样分析。结果龙胆、夏枯草和野菊花阴性对照品溶液均无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定6次，以对照品溶液质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷的线性回归方程分别为Y龙=14131X龙+4349（r=1.0000，n=6），Y迷=83 851X迷-18 242（r=0.999 7，n=6），Y蒙=24 770X蒙-999（r=1.000 0，n=6）。结果表明，龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷质量浓度分别在5.29～169.34μg/mL，1.00～32.09μg/mL，2.28～72.88μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面积基本不变，RSD分别为0.06%，0.22%，0.22%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20191227）样品2 g，精密称定，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷含量的RSD分别为0.87%，1.10%，1.43%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20191227）样品适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，16，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定。结果龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷峰面积的RSD分别为0.25%，0.26%，0.39%（n=7），表明供试品溶液在常温下放置24 h稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20191227）1 g，精密称定，共9份，分别精密加入混合对照品贮备液0.25，0.40，0.55 mL，各3份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下方法进样测定，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为20190325，20191227，20200520）样品，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图，并计算样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.2 Content determination of gentiopicroside，rosmarinic acid and buddleoside in the samples（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 检测波长选择

中成药多为复方制剂，成分多且复杂，单一波长有时无法同时检测多种组分。故采用双波长切换法可极大地提高检测效率。分别配制含龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷质量浓度为20μg/mL的对照品溶液和供试品溶液，用二极管阵列检测器于200～400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描。结果显示，迷迭香酸、蒙花苷、龙胆苦苷分别在330，334，274 nm波长处有最大吸收，但龙胆苦苷于330 nm波长附近几乎无吸收。故选定274 nm（0～20 min）和334 nm（21～40 min）作为检测波长。

3.2 流动相选择

曾考察甲醇-水、乙腈-0.1%三氟乙酸、乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相系统，梯度洗脱。结果采用甲醇-水流动相系统时，迷迭香酸不出峰；采用乙腈-0.1%三氟乙酸和乙腈-0.1%磷酸水溶液系统时，3种目标组分的分离效果均良好，峰形尖锐且对称，定量结果准确。考虑三氟乙酸具有轻微的毒性，故采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相系统。

3.3 提取条件选择

分别考察以100%，75%，50%甲醇作为溶剂时对鼻咽清颗粒中3种成分的提取效果。结果表明，100%甲醇时蒙花苷提取效果明显优于另外2种溶剂，而龙胆苦苷和迷迭香酸则无明显差异，故选择甲醇作为提取溶剂。确定提取溶剂后，分别考察超声处理15，30，60 min和加热回流30，60，90 min的提取效果。结果表明，超声处理30 min和加热回流60 min对3种有效成分基本提取完全，数据无明显差异。考虑超声操作简易方便，故选定超声处理30 min。

3.4 含量限度确定

方中龙胆、夏枯草和野菊花均收载于2015年版《中国药典（一部）》[14]，含量测定指标成分分别为龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷，按照药典规定的含量测定方法对这3味药材进行检测，结果均大于药典规定的限值。根据公式[转移率（%）=成药中被测物质的含量/（药材被测物质的含量×处方量）×100%]分别计算转移率，结果龙胆苦苷、迷迭香酸、蒙花苷的转移率分别为32.16%～51.16%，33.43%～43.85%，26.25%～45.47%。考虑药材质量及工艺提取率，暂将限度定为2015年版《中国药典（一部）》规定药材含量的限值×处方量×平均转移率，最终将鼻咽清颗粒中龙胆苦苷、迷迭香酸和蒙花苷含量的限度定为0.200，0.024，0.043 mg/g。为了确保限值制订的合理性，以后将继续扩大样本量研究。