李 赛，苏凌璎

（1.扬州大学附属淮安市妇幼保健院，江苏 淮安 223000；2.南京医科大学附属淮安第一医院，江苏 淮安 223000）

丙戊酸钠（VPA）是治疗儿童癫痫的一线药物[1-2]，肝毒性为VPA最严重的不良反应，常见于2岁以下儿童[3-4]。VPA体内代谢产物多达50种，其中由细胞色素P450（CYP450）催化生成的2-丙基-4-戊烯酸（4-ene-VPA）被认为是VPA产生肝毒性的主要物质[5-8]，可抑制线粒体β氧化，引起肝细胞脂质变性，与谷胱甘肽反应，降低机体的抗氧化能力，诱导肝损伤[9-10]。目前，主要采用气相色谱-质谱联用法[11]、液相色谱-质谱联用法[12]及高效液相色谱（HPLC）法测定4-ene-VPA，但前2种方法由于成本过高，不适于在医疗机构广泛开展。本研究中参考文献[13]，建立了同时测定癫痫患儿血清中VPA及其代谢产物4-ene-VPA血药浓度的HPLC法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1220型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；TDL80-2B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；AL104型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为0.1mg）；WH-3型微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；XO-3200D型超声清洗机（南京先欧仪器制造有限公司，功率为80 W，频率为40 kHz）；DHG-9101-A型电热鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）。

1.2 试药

VPA口服溶液（赛诺菲＜杭州＞制药有限公司，批号为AHG0565，规格为每支300 mL∶12 g）；VPA对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100963-201101，纯度为94.5%）；4-ene-VPA对照品（加拿大Toronto Research Chemicals公司，批号为1-LIJ-87-2，纯度≥98%）；环己甲酸（批号为20120304），2-溴代-4-硝基苯乙酮（批号为20120703），甲醇、乙腈、正己烷、三乙胺（色谱纯），浓硫酸（分析纯），均购自国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水；空白血清由扬州大学附属淮安市妇幼保健院检验科提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Bennetnach C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-水（75∶25，V/V）；流速：1 mL/min；检测波长：243 nm；柱温：25℃；进样量：10μL；液相色谱工作站：Ezchrom Elite。

2.2 溶液配制

取VPA对照品10.00 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为1mg/mL的VPA对照品贮备液；取4-ene-VPA对照品5.00mg，精密称定，置5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得质量浓度为1 mg/mL的4-ene-VPA对照品贮备液；于-20℃冰箱中保存，备用。取环己甲酸4.00 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，混匀，即得质量浓度为40 mg/L的内标提取液；取2-溴代-4-硝基苯乙酮100 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容，即得质量浓度为10 mg/mL的2-溴代-4-硝基苯乙酮溶液；于4℃冰箱中保存，备用。

2.3 样品处理

取患儿血清250μL，加入500μL乙腈，沉淀蛋白，加入250μL（1 mol/L）稀硫酸，涡旋1 min，加入内标提取液1 mL，涡旋2 min；以4000r/min的速率离心15 min，吸取上层有机相600μL置试管中，加入碱化液100μL、衍生化试剂50μL，混匀，于40℃超声处理（功率为80W，频率为40kHz）5 min，氮气吹干。用100μL乙腈复溶，进样。

2.4 方法学考察

专属性试验：按2.3项下方法前处理样品，按2.1项下色谱条件进样测定。在此色谱条件下，VPA，4-ene-VPA与血清内源性物质均分离良好；4-ene-VPA、内标物质与VPA保留时间分别为7.93，10.55，17.88 min。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取VPA对照品贮备液和4-ene-VPA对照品贮备液各适量，置试管中，40℃吹干，加入空白血清250μL复溶，配成VPA质量浓度分别为5，10，20，40，80，160，200μg/mL和4-ene-VPA质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，16.0μg/mL的系列标准血清样品，各7份。按2.3项下方法操作，分别以VPA和4-ene-VPA的血药浓度（X）为横坐标、所测峰面积与内标物质峰面积之比（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程YV=0.004 7 XV-0.004 8，r=0.997 6（n=7）；Ye=0.018 5X e-0.008 3，r=0.997 8（n=7）。结果表明，VPA和4-ene-VPA血药浓度分别在5～200μg/mL和0.5～16.0μg/mL范围内与所测峰面积和内标物质峰面积比值的线性关系良好。

精密度试验：按线性关系考察项下方法分别配制VPA高、中、低（100，40，10μg/mL）和4-ene-VPA高、中、低（8，4，1μg/mL）3种质量浓度的血清样品，按2.3项下方法前处理，按2.1项下方法进样测定，每日重复测定5次，共测定5 d，记录血清中VPA和4-ene-VPA实测血药浓度，计算日内、日间RSD。结果见表1。

表1 方法学考察结果（n=5）Tab.1 Results of the methodological investigation（n=5）

稳定性试验：取精密度试验项下3种质量浓度的VPA和4-ene-VPA血清样品各5份，分别考察其在室温放置12，24 h，反复冻融3次，-80℃冰冻放置15，30 d的稳定性。结果见表1，表明各质量浓度的血清样品稳定性良好。

加样回收试验：按精密度试验项下方法分别配制VPA高、中、低（100，40，10μg/mL）和4-ene-VPA高、中、低（8，4，1μg/mL）3种质量浓度的血清样品，按2.3项下方法前处理，按2.1项下色谱条件进样测定，每个血药浓度平行5份，按公式[相对回收率（%）=实测血药浓度/理论血药浓度×100%]计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=5）Tab.2 Results of the recovery test（n=5）

2.5 癫痫患儿血药浓度测定

采用HPLC法测定12例癫痫患儿血清中VPA和4-ene-VPA的血药浓度。VPA治疗5 d后，于晨起服药前采集静脉血1～2 mL，取血清，按2.3项下方法前处理。结果见表3。可见，2例合并托吡酯患儿血清中4-ene-VPA血药浓度明显降低，与张玲敏等[2]的研究结果类似，但本研究中选取病例数较少，目前无法形成具体结论，还需进一步研究。

表3 12例癫痫患儿血药浓度测定结果Tab.3 Results of the determination of blood concentration in 12 children with epilepsy

3 讨论

联合用药可能会干扰VPA和4-ene-VPA血药浓度的测定结果，本试验中考察了临床可能联用的药物，如苯巴比妥、苯妥英钠、地西泮、卡马西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦等对测定结果的影响。结果，上述药物在该色谱条件下均对目标峰无干扰。

前期研究发现，乙腈作为蛋白沉淀剂不仅能有效沉淀蛋白，还能减弱加入内标提取液后引起的乳化现象，缩短血样处理时间。乙腈同样适用于测定血清中4-ene-VPA的血药浓度[14]，在复溶过程中，乙腈具有较好的溶解性能，尤其是检测低血药浓度4-ene-VPA时。

VPA与4-ene-VPA分子结构相似，均无特征性的紫外吸收基团。故适宜的衍生化反应条件是准确测定VPA及4-ene-VPA血药浓度的关键。目前，应用较多的衍生化反应条件为70℃条件下水浴反应15 min。但水浴温度过高，可能会导致水蒸气进入反应液，影响衍生化反应进行。另外，在水浴反应过程中，三乙胺的挥发也会在一定程度上影响反应进行，导致衍生化反应不完全。本研究中创新性地采用超声法进行衍生化反应，与水浴加热相比具有反应快、反应完全等优点[15]。