胡林义 张春花 吴 玲 魏善闯 刘 英 方 芳

(江苏省淮安市妇幼保健院妇科，淮安市 223002，电子邮箱：hulinyi223002@163.com)

子宫内膜异位症是指有活性的内膜细胞种植在子宫内膜以外的位置而引起的妇科疾病，是中青年妇女的常见病之一，主要临床症状为痛经、月经不调、慢性盆腔疼痛，严重者可影响生殖系统功能，造成不孕。子宫内膜异位症一般为良性病变，但具有恶性肿瘤的生物学特性，如浸润、转移、复发等[1]。因此，寻找能特异性地评估子宫内膜异位患者病情发展及预后的相关标志物，具有重要的临床意义。研究发现，微小RNA(microRNA，miRNA)通过靶向调控mRNA表达，参与机体病理生理的各个过程[2]。有研究显示，miRNA-92a在卵巢癌中异常表达，参与肿瘤细胞的增殖和凋亡[3]，而子宫内膜异位症恶变后约有80%进展为卵巢癌[4]。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 gene，PTEN)可参与细胞周期的调控，在卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌等妇科疾病中发挥调节作用[5]。本研究通过检测子宫内膜异位症患者血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平，探讨其与患者预后之间的关系，以期为临床评估子宫内膜异位症患者的预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2019年12月于本院妇产科行腹腔镜手术的200例子宫内膜异位症患者为研究组，均经术后病理检查确诊，年龄26～43(34.57±5.63)岁。纳入标准：(1)月经规律，无内分泌系统、免疫系统疾病；(2)术前3个月内无内分泌类、激素类或抗生素类药物治疗史；(3)非妊娠患者；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并其他子宫疾病；(2)哺乳期患者；(3)有精神类疾病；(4)合并恶性肿瘤。另选择同期于我院行腹腔镜子宫肌瘤切除术的120例患者为对照组，年龄25～41(33.83±4.27)岁。纳入标准：(1)均确诊为子宫肌瘤；(2)临床资料完整；(3)符合腹腔镜手术指征。排除标准：(1)合并其他妇科或内分泌疾病者；(2)妊娠、哺乳或绝经期者；(3)有精神类疾病者。两组患者的年龄差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者均对本研究知情同意，本研究获得本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 血样采集及处理:所有患者于入院后次日清晨抽取空腹静脉血4 mL，4℃下3 000 r/min离心15 min后取上层清液于干净EP管，-20℃保存待测。

1.2.2 血清miRNA-92a水平检测：采用荧光定量聚合酶链式反应检测患者血清miRNA-92a水平。利用TRIzol(Sigma公司，批号：20171205、20181024)提取血清总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA纯度，以吸光度260/吸光度280值在1.8～2.0之间为纯度较好，以纯度较好的总RNA进行后续实验。使用PrimeScript RT反转录试剂盒(北京智杰方远科技有限公司，批号：20171228、20181219)将RNA反转录为cDNA，严格按照说明书操作步骤执行。循环参数：95℃，预变性5 min；90℃，变性15 s；60℃，退火20 s；72℃，延伸30 s；共40个循环。以U6为内参，miRNA-92a上游引物为5′-ACAGGCCGGGGACAAGTGCAATA-3′，下游引物为5′-GCTGTCAACGATACGCTACGCTACGTA-3′；U6上游引物为5′-GGGCTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-GAGCGTGCAGATAATTGACAAGG-3′。利用2-ΔΔCt法计算miRNA-92a的相对表达水平。实验重复3次，取平均值。

1.2.3 血清PTEN水平的检测：采用酶联免疫吸附法检测患者血清PTEN水平，试剂盒购自上海羽朵生物科技有限公司(批号：20180514)，操作步骤按试剂盒说明书执行。

1.2.4 血清雌二醇、孕酮、促卵泡激素水平的检测：采用酶联免疫吸附法检测患者血清雌二醇、孕酮、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平，试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司(批号：20180107、20180625、20180316)，检测方法参照试剂盒说明书。

1.3 子宫内膜异位症复发的判定 术后随访3个月，观察子宫内膜异位症患者的复发情况，分为复发组和未复发组。子宫内膜异位症复发的诊断标准[6]：(1)术后病灶缩小或消失，临床症状缓解，但3个月后再次出现临床症状，且恢复到治疗前水平，甚至加重；(2)再次出现盆腔阳性症状，甚至加重；(3)再次出现子宫内膜异位症病灶。符合其中之一者即判定为子宫内膜异位症复发。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验。采用Pearson法分析复发组患者血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平与内分泌指标之间的相关性，以及血清miRNA-92a相对表达水平与PTEN水平之间的相关性；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平及二者联合检测预测子宫内膜异位症复发的价值，曲线下面积的比较采用Z检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究组和对照组患者血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平的比较 研究组患者血清miRNA-92a相对表达水平高于对照组，血清PTEN水平低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 研究组和对照组患者血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平的比较(x±s)

2.2 子宫内膜异位症患者血清miRNA-92a相对表达水平与PTEN水平之的相关性分析 子宫内膜异位症患者血清miRNA-92a的相对表达水平与PTEN水平之间呈负相关(r=-0.455，P<0.001)。

2.3 复发组和未复发组患者血清miRNA-92a的相对表达水平、PTEN水平及内分泌指标水平的比较 术后随访3个月，子宫内膜异位症患者复发64例。复发组患者血清miRNA-92a的相对表达水平及雌二醇、孕酮、FSH水平均高于未复发组，PTEN水平低于未复发组(均P<0.05)。见表2。

表2 复发组和未复发组患者血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平及内分泌指标水平的比较(x±s)

2.4 子宫内膜异位症复发患者血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平与内分泌指标水平的相关性分析 子宫内膜异位症复发患者血清miRNA-92a相对表达水平与雌二醇、孕酮、FSH水平均呈正相关(均P<0.05)，PTEN水平与雌二醇、孕酮、FSH水平均呈负相关(均P<0.05)，见表3。

表3 复发组患者血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平与内分泌指标水平的相关性分析

2.5 血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平对子宫内膜异位症复发的预测价值 ROC曲线分析结果显示，血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平预测子宫内膜异位症复发的曲线下面积分别为0.831(95%CI：0.785，0.870；P=0.025)、0.867(95%CI：0.824，0.902；P=0.024)，最佳截断值分别为1.77、0.80 ng/mL，对应的灵敏度分别为85.00%、91.00%，特异度分别为77.50%、73.33%；二者联合检测预测子宫内膜异位症复发的曲线下面积为0.965(95%CI：0.932，0.987；P=0.007)，灵敏度和特异度分别为92.00%、90.71%。二者联合检测预测子宫内膜异位症复发的曲线下面积高于血清miRNA-92a相对表达水平和血清PTEN水平单独检测(Z=4.492，P<0.001；Z=3.121，P=0.002)。见图1。

图1 血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平及二者联合检测预测子宫内膜异位症复发的ROC曲线

3 讨 论

子宫内膜异位症的病因和发病机制较为复杂，大多数学者认为在其病灶形成过程中，黏附性血管的形成是其病理生理基础[7]。miRNA是一类非编码内源性小RNA分子，通过转录后降解mRNA或与3′端非翻译区结合来抑制翻译，从而参与调节细胞的增殖、分化、凋亡等过程[8]。研究表明，miRNA-92a在血管生成、器官发育及促进肿瘤细胞的增殖和分化方面发挥重要的调控作用[9]。王利娟等[10]发现，miRNA-92a在宫颈癌细胞中的表达水平升高，其可能通过靶向下调基质金属蛋白酶2和Survivin蛋白的表达水平，参与肿瘤的发展进程。黄晓艳等[11]的研究证实，miRNA-92a对宫颈癌有一定的诊断价值，推测miRNA-92a可作为宫颈癌筛查和监测的潜在标志物。本研究结果显示，研究组患者血清miRNA-92a的相对表达水平高于对照组，且复发组患者的血清miRNA-92a的相对表达水平高于未复发组(P<0.05)，提示miRNA-92a在子宫内膜异位症患者中异常高表达，其高表达可能通过促进黏附性血管增生和病灶形成，参与病情的发生发展过程，对患者预后产生不良影响。

PTEN作为一种重要的信号传导分子，参与调控细胞周期，在抑制细胞过度增殖、促进细胞凋亡的过程中发挥重要作用[12]，但其抑制细胞增殖的具体机制尚不明了。有学者猜测，抑癌基因PTEN可能是一种促凋亡因子[13]，可诱导机体内正常或异常的细胞凋亡。子宫内膜异位症常发生于卵巢，具有恶变倾向，可发展为子宫内膜异位症相关卵巢癌。苗芸等[14]发现，PTEN在卵巢癌组织中的阳性表达率明显低于卵巢交界性肿瘤组织，而PTEN阳性患者的总生存时间长于PTEN阴性患者，提示PTEN低表达的卵巢癌患者预后更差。Russo等[15]的研究显示，PTEN缺失可导致细胞迁移、侵袭作用加强及关键调控因子WNT4表达上调，该发现有助于明确卵巢癌早期阶段的发病机制，具有重要的临床意义。本研究结果显示，研究组患者PTEN水平低于对照组，复发组患者PTEN水平低于未复发组(P<0.05)，与陈华等[16]的研究结果相似。子宫内膜异位症的发病机制尚不明确，可能是多个因素、多条通路相互影响的结果。赵曦雯等[17]利用生物信息学方法预测PTEN为miRNA-92a的一个下游靶点，miRNA-92a通过与PTEN 3′-非翻译区结合来靶向负调控PTEN在平滑肌细胞中的表达。本研究结果显示，子宫内膜异位症患者血清miRNA-92a相对表达水平与PTEN水平呈负相关(P<0.05)，提示miRNA-92a可能通过靶向负调控PTEN的表达，参与子宫异位症患者病变细胞的增殖、凋亡过程，高水平的miRNA-92a抑制PTEN蛋白表达，但其具体作用机制有待进一步研究。

既往研究表明，子宫内膜异位症的发生与雌激素水平密切相关[18]，雌激素分泌紊乱可能诱发细胞周期阻滞，细胞分裂异常，从而导致子宫内膜异常增生，进而发生病变。本研究结果显示，子宫内膜异位症复发组患者的血清雌二醇、孕酮、FSH水平均高于未复发组(均P<0.05)，这可能是由于复发组患者子宫内膜异位病灶重新出现或增多，雌激素不断累积，导致垂体负反馈调节作用敏感性减弱，从而使血清雌二醇、孕酮、FSH水平升高。Pearson相关分析结果显示，子宫内膜异位症复发患者的血清miRNA-92a相对表达水平与雌二醇、孕酮、FSH水平均呈正相关，PTEN水平与雌二醇、孕酮、FSH水平均呈负相关(均P<0.05)，提示血清miRNA-92a、PTEN可能共同参与调控子宫内膜异位症患者的内分泌代谢，促进病变的发展进程。本研究采用ROC曲线分析进一步探讨血清miRNA-92a、PTEN水平对子宫内膜异位症复发的预测价值，结果显示，血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平预测子宫内膜异位症复发的曲线下面积分别为0.831、0.867，当miRNA-92a>1.77、PTEN<0.80 ng/mL时，子宫内膜异位症患者术后复发的概率较高，提示血清miRNA-92a相对表达水平和PTEN水平对子宫内膜异位症术后复发有一定的预测价值；二者联合预测子宫内膜异位症复发的曲线下面积为0.965，高于血清miRNA-92a相对表达水平和血清PTEN水平单独预测时的曲线下面积，提示联合二者的检测水平更有利于评估子宫内膜异位症患者的预后。

综上所述，子宫内膜异位症患者血清miRNA-92a呈高表达，PTEN呈低表达，miRNA-92a可能通过靶向负调控PTEN的表达参与患者病情的发展，二者对子宫内膜异位症复发具有一定预测价值且二者联合预测的价值更高。