孙 妍，王 静，侯 喆，武天元，王伟明

(1黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036；2黑龙江中医药大学·黑龙江 哈尔滨 150040)

麦冬具有养阴生津、润肺清心的功效，主要用于肺燥干咳、阴虚劳嗽、津伤口渴等症；现代研究表明，麦冬块根中富含多糖、皂苷、黄酮等有效成分，具有抗心肌缺血、抗心律失常、保护心肌、改善肝肺损伤及镇咳等药理作用[1-2]。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是对水有特异性通透作用的小分子膜蛋白，分布于呼吸道上皮表层的柱状上皮细胞顶膜和黏膜下腺腺泡细胞顶膜，以及肺泡Ⅰ型上皮细胞顶膜，其表达影响着气道表面液体的分泌量和黏度，进而影响黏液纤毛的清除功能[3]。本实验观察了麦冬有效部位对肺炎支原体肺炎小鼠肺组织AQP1、AQP5表达的影响，旨在对其润肺生津的作用机理进行探讨

1 材料

1.1 实验动物 100只健康成年BALB/c小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001。

1.2 菌株 肺炎支原体国际标准株(ATCCFH15531),购于美国菌株保藏中心。

1.3 药物及试剂 麦冬饮片：河北安国振宇药业有限公司，批号：130109，经鉴定为四川麦冬 Ophiopogon japonicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥块根；阿奇霉素分散片：哈药集团制药六厂，批号：30130502；养阴清肺糖浆：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：3150021。TRIzol试剂：美国Invitrogen；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit：TaKaRa 公司；AQP1、AQP5引物、β-actin引物：哈尔滨博仕生物技术有限公司；PPLO培养基：Becton，Dickinson and Company，USA。

1.4 主要仪器 DL-CJ-1W生物净化工作台：北京东连哈尔仪器制造有限公司；MDF-382E-80℃低温冰箱：日本三洋公司；Milli-Q Reference system自动双重纯水蒸馏器：MILLI-Q公司；SorvaⅡ ST16低温离心机：Thermo公司；2、20、200μL微量加样器：Eppendoff公司；9600荧光定量PCR仪：杭州博日有限公司；Infinite M200 Pro酶标仪：Tecan公司；KD-TS3A自动组织脱水机：浙江金华科迪仪器设备有限公司；KD-BM生物组织包埋机：浙江金华科迪仪器设备有限公司；RM2235组织切片机：德国莱卡；BX4-1生物显微镜：OLYMPUS公司。

2 方法

2.1 麦冬有效部位提取 麦冬总皂苷：麦冬饮片加10倍量75%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，提取液回收乙醇得到浸膏后，经过D101大孔树脂柱，收集70%乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇后冷冻干燥，得麦冬总皂苷；以皂苷提取的最佳工艺条件进行提取，麦冬总皂苷的得率为2.17%，总皂苷的含量为59.21%。麦冬多糖：麦冬饮片加10倍量75%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，提取后挥干乙醇得干燥的麦冬药渣，经水提醇沉、依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤，洗涤后减压得到粗多糖粉末，用sevage法脱蛋白，得麦冬多糖；麦冬粗多糖百分含量为62.16%，脱蛋白后含量可以达到64.38%，多糖提取率为11.8%。

2.2 肺炎支原体培养 将MP菌株按1∶9加入到PPLO完全培养基中，置37 ℃生化培养箱进行培养，每天观察颜色变化，培养液由红色变为黄色并澄清透明时即为支原体生长。将处于对数生长期的MP进行CCU定量，常规冻存备用。

2.3 动物分组、造模及给药 100只BALB/c小鼠，随机分为10 组，每组10只。分别为正常对照组、模型对照组、阿奇霉素组、养阴清肺组、麦冬多糖高剂量组、麦冬多糖中剂量组、麦冬多糖低剂量组、麦冬皂苷高剂量组、麦冬皂苷中剂量组、麦冬皂苷低剂量组。除正常对照组外，其余各组用乙醚麻醉，然后用无菌注射器吸取106CCU/mL MP 20μL，滴鼻复制MP感染模型，连续感染3 d。成模后正常组和模型组灌胃等容积生理盐水，阿奇霉素组给药5 d(第1天65 mg/kg，第2～5天给32.5 mg/kg)，养阴清肺组(5 mL/kg)、麦冬多糖高剂量组(81.2 mg/kg)、麦冬多糖中剂量组(40.6 mg/kg)、麦冬多糖低剂量组(20.3 mg/kg)、麦冬皂苷高剂量组(66.8 mg/kg)、麦冬皂苷中剂量组(33.4 mg/kg)、麦冬皂苷低剂量组(16.7 mg/kg)，每天1 次，连续给药6 d。

2.4 观察指标及测定 末次给药后24 h，颈椎脱臼处死小鼠，剪取左肺组织，放入4%甲醛中固定；剪取右肺组织中叶，放入无RNA酶的微量离心管中，-80 ℃保存备用，用于PCR检测。

2.4.1 肺组织病理变化的光镜观察 取甲醛固定的肺组织，用乙醇梯度脱水，二甲苯中透明2次，放入石蜡内进行包埋。蜡块修好后固定于石蜡切片机上切片，将完全展开的蜡片贴附于清洁载玻片上，常规HE染色，显微镜下观察肺组织病理改变。

2.4.2 肺组织AQP1、AQP5mRNA表达的Real-time PCR检测 取100 mg组织置于离心管中，加入适量去离子水，用匀浆机打匀，加入1 mL trizol(预冷)提取RNA；以DEPC H2O做空白调零，混匀样品在260、280 nm波长下读数，估算核算纯度，计算总RNA浓度，调整样品体积。以β-actin为内参照，AQP1正向引物：5’-CGCCACGGCCATTCTC-3’，反向引物：5’-TTGCGGCCAAGTGAATTG-3’；AQP5正向引物：5’-CCCAGCCCGATCTTTCG-3’，反向引物：5’-TCCTACCCAGAAGACCCAGTGA-3’；β-actin 正向引物：5’-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3’，反向引物：5’-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3’。PCR扩增仪进行循环扩增：42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,1 cycle；95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40 cycle；95 ℃ 10 s,65 ℃ 15 s,95 ℃ 10 s。采用2-ΔΔCt公式，相对定量的方法进行计算，得出的AQP1、AQP5mRNA相对表达量。

3 结果

3.1 各组小鼠肺组织病理学观察 正常组小鼠肺组织结构清晰正常，无间质性肺炎改变，仅个别偶有淋巴样细胞浸润；与正常组比较，模型组小鼠可见肺组织有明显炎症改变；与模型组比较，阿奇组、养阴清肺组和麦冬多糖高、中剂量组及麦冬皂苷低剂量组的肺组织炎症较模型组明显减轻，具有显著差异(P<0.01)。各组病理结果见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理变化的光镜观察(HE，×20)

3.2 各组小鼠肺组织AQP1、AQP5mRNA表达的RT-PCR检测结果 见表1。

表1 各组小鼠肺组织AQP1、AQP5mRNA 表达水平比较

4 讨论

肺炎支原体肺炎主要是由肺炎支原体引起的急性呼吸道感染和肺部炎症，同时伴有咽炎、支气管炎及肺炎。主要通过呼吸道传播，通常发生于学龄前儿童或家中无抵抗力者发病。西医临床治疗以大环内酯类抗菌药物为首选，如红霉素、罗红霉素和阿奇霉素。传统中医药则无“支原体”一说，且将其归为“肺炎喘嗽”范畴，认为肺炎乃外邪犯肺，肺失宣降，水液输化无权则滞留为痰，痰阻气道，肺气因其郁闭[4]所致。无论西医肺泡间浸润还是中医范畴肺气郁闭，均与肺内水运失衡有关。

麦冬又名麦门冬，是我国传统中药中一味滋阴药。首载于《神农本草经》,历代本草也都有记载。据2015版《中国药典》记载，麦冬用于肺燥干咳，阴虚痨嗽，喉痹咽痛，津伤口渴，内热消渴，心烦失眠，肠燥便秘等症。现代药理研究表明麦冬含有多糖类、甾体皂苷类、高异黄酮类、氨基酸等成分[5]。

水通道蛋白是新近发现的一种类特异性快速转运水分子的细胞膜通道类蛋白质，在细胞上选择性的表达，揭示了生物机体水代谢的基本机制。Towne[6]发现腺病毒感染小鼠所致的肺炎，AQP1、AQP5不但肺部感染部位表达，而且在全肺表达，但AQP1、AQP5表达均降低，这是首次研究显示AQP与肺部感染、水肿有关，AQP1、AQP5参与肺部感染时的液体传导。AQP1、AQP5双基因敲除小鼠，其肺泡毛细血管间水转运通透性下降10倍以上，并导致小鼠气道黏膜下腺分泌功能的降低[6]。

本实验运用RT-PCR技术检测AQP1、AQP5mRNA的表达情况，实验结果显示，MPP模型组小鼠肺组织AQP1、AQP5mRNA的表达量明显降低，提示MPP可致肺部水分的流失，进而出现“肺燥”症状，麦冬多糖组及麦冬皂苷组与模型组比较，均可使AQP1、AQP5mRNA的表达升高；提示麦冬有效部位可通过调节AQP1、AQP5mRNA的表达，纠正肺部水液失调，发挥润肺生津作用，进而改善MPP肺组织的病理变化。为临床应用提供了实验室依据。