李钰飞,许俊香,刘本生,孙钦平,李吉进,刘建斌,郎乾乾,孙仁华,靳红燕

(1.北京市农林科学院植物营养与资源研究所 北京 100097;2.农业农村部农业生态与资源保护总站 北京 100125;3.中国城市建设研究院有限公司西北分院 北京 100120)

20世纪80年代以来,我国规模化养殖业得到了快速发展,同时伴随着畜禽粪便的大量产生,极大增加了面源污染风险[1]。沼气工程通过厌氧发酵工艺处置养殖废弃物,使得环境污染得到了有效改善[2]。与此同时,产生的副产物沼液含有丰富的养分和微量元素,还可作为土壤改良剂或有机肥料应用于种植业[3]。大量研究证实,合理施用沼液有利于改善土壤理化性状[4-6],提高作物产量和品质[7-8],防控作物土传病害[3,9-10]。

鸡粪、猪粪和牛粪是沼气工程常用的发酵原料,不同种类的畜禽粪便特性存在明显差异。例如鸡粪各种养分含量均较高,含有大量易分解有机物[11],养分释放快,其主要作用是提高或维持作物产量;牛粪相对来说养分较低,但碳氮比高,有研究表明长期施用牛粪可以改善土壤物理性状[12-13];Hafez[14]发现牛粪比鸡粪更有利于降低土壤容重。不同种类畜禽粪便经沼气发酵后碳氮比均会降低[15],但依然在一定程度上保持着差别[16]。例如赵凤莲等[17]的盆栽试验证实鸡粪沼肥要比牛粪沼肥增产明显,而后者的养分释放较为缓慢。由此可见,不同来源的沼液进入土壤后对地下生态过程产生的影响也势必存在差异。

土壤生物是地下生态过程的执行者[18],其中土壤微生物是土壤生物类群的重要组成部分。作为食物网中的分解者[19],其占据食物网80%以上的生物量[20],参与土壤有机质的分解与合成、养分的固定与释放以及污染物的降解等过程,并且与土壤团聚体的形成密切相关[21]。土壤扰动会导致微生物群落结构、代谢特征和功能多样性的变化,反过来这些也可作为土壤质量评价的重要指标[22]。针对土壤微生物群落对沼液施用的响应,已有不少学者从不同角度开展了研究,例如沼液肥与其他肥料的对比[15,23],不同的沼液用量[2,24],沼液与其他材料配施[25-26],但尚少见不同发酵原料产生的沼液对土壤微生物群落影响的报导。

基于以上的研究背景,本研究将通过室内培养试验,对比鸡粪、牛粪和猪粪3 种常见来源的沼液加入土壤后的土壤微生物碳代谢特征,并结合土壤理化指标和微生物生物量碳氮指标阐明不同来源沼液引发短期的土壤微生物群落变化的差异,为沼液的资源化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 土壤及样品采集

本研究为室内培养试验,在北京市农林科学院植物营养与资源研究所温室内进行。试供土壤采集自北京市大兴区北京青圃有机农业专业合作社温室,

土壤基础理化性状为:有机质19.7 g·kg−1,全氮1.2 g·kg−1,速效磷72.7 mg·kg−1,有效钾194.9 mg·kg−1,pH 8.20,电导率107.7 μS·cm−1。选取1 m2作为采样样方,用铁铲挖取表层0～20 cm 土壤带回实验室,并于1 周内完成试验布置。沼液来源于大兴区不同的沼气站,其中鸡粪沼液采集自留民营沼气站,牛粪沼液源自于赵庄子镇沼气站,猪粪沼液取自北蒲州沼气站。3 种沼液均为厌氧发酵罐当天的流出液,取回后于4 ℃冰箱保存,理化性质见表1。

表1 不同来源沼液的化学性状Table 1 Chemical properties of different biogas slurry

1.2 试验布置

试验设置4 个处理:鸡粪源沼液(FS)、猪粪源沼液(PS)、牛粪源沼液(CS)和对照(CK),每个处理3次重复,随机区组排列。沼液添加量依据等氮原则(0.17 g·kg−1鲜土),不同处理稀释成等体积的沼液加入土壤,对照处理以等量的蒸馏水代替。试验所用盆为宽8 cm、高10 cm 的方形盆,每盆加入过2 mm筛的土壤450 g,然后加稀释后沼液100 mL,避光培养。培养期间,每隔3 d 按等重法补充水分。所有样本于60 d 后取样,一部分土样置于4 ℃冰箱冷藏用于测定微生物量碳氮和微生物碳代谢,剩余部分风干处理用于测定土壤理化性质。

1.3 土壤化学性质分析

土壤铵态氮和硝态氮以1 mol·L−1NaCl 浸提后用流动分析仪测定,有机质含量测定方法为重铬酸钾氧化法,全氮含量采用凯式蒸馏法测定,有效磷含量采用NaHCO3提取钼锑抗比色法测定,速效钾含量测定方法为乙酸铵浸提-火焰光度法,pH 采用pH 计测定(水土比2.5∶1),电导率用电导仪测定(水土比5∶1)[27]。

1.4 土壤微生物分析

土壤微生物量碳氮采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法测定,转换系数为0.45[28]。微生物群落评价采用基于微生物碳代谢功能的BIOLOG 微平板培养法测定。参考林先贵[29]的方法,取鲜土10 g 加入三角瓶中,于涡旋震荡仪上震荡2 min。吸取1 mL 液体于小试管中,震荡30 s,吸取小试管中土壤悬浊液3 mL 转移至离心管中,震荡20 s,再转移至V 型槽中,用八道移液枪向BIOLOG 板每孔加入150 μL 液体,置于25 ℃培养箱培养。前2日每隔12 h 用酶标仪测定吸光度,从第3日起每隔24 h 测定吸光度(590 nm),总计培养7 d。采用平均吸光度(AWCD)、Shannon 丰富度指数(H′)、Simpson 优势度指数(1/D)和McIntosh 均一度指数(U)来评价微生物群落。

式中:Ci为各孔的吸光值,R为对照孔的吸光值,当Ci−R为负数时记为零[29]。

式中:pi为第i孔相对吸光度与整板平均相对吸光度总和的比率。

式中:ni是第i孔的相对吸光度(Ci−R),N是相对吸光度总和,Simpson 指数用1/D表示[30]。

式中:ni是第i孔的相对吸光度(Ci−R)。

1.5 统计分析

采用单因素方差分析比较土壤化学指标和微生物指标在不同处理间的差异,多重比较方法为LSD,设置显著性水平为P<0.05。方差分析前先进行齐次性检验,对于不满足齐次性假设的数据进行对数,开平方或反正弦转换;若仍不满足要求,则采取非参数检验方法(Kruskal-Wallis),并用Mann-Whitney 两两比较处理间的差异。所有统计分析在SPSS 16.0 中完成。

采用主成分分析(PCA)呈现处理间微生物群落的差异,分析前微生物碳代谢数据进行ln(10 000x+1)转换。分析在Canoco 5.0 中完成。

2 结果与分析

2.1 不同来源沼液对土壤理化性状的影响

添加不同来源的沼液对土壤有机质含量无显著影响,但对其他土壤养分总体表现出不同程度的促进作用(表2)。与对照相比,沼液对土壤硝态氮含量的增加效果表现为猪粪沼液>鸡粪沼液>牛粪沼液(P<0.05);对于土壤铵态氮含量,猪粪沼液处理显著高于牛粪沼液处理(P<0.05),而各沼液与对照处理并无显著差异;与此同时,不同沼液均显著提高了土壤全氮含量(P<0.05)。各处理中有效磷含量最高的是鸡粪沼液处理,有效钾最高的是猪粪沼液处理,而这两个指标在对照土壤中均最低。此外,施用沼液后各处理的pH 和电导率值也均有不同程度升高。

表2 不同来源沼液对土壤理化性状的影响Table 2 Effects of different biogas slurry on soil physical and chemical properties

2.2 不同来源沼液对微生物量碳氮的影响

经过60 d 的培养,牛粪沼液处理获得了最高的微生物生物量碳,显著高于猪粪沼液(P<0.05)(图1),但与对照和鸡粪沼液处理相比并无显著差异,而添加猪粪沼液则显著降低了微生物生物量碳(P<0.05),但其同鸡粪沼液的结果相比并无显著差异。微生物生物量氮在不同处理间尽管存在差别,但并未达显著差异水平。

2.3 不同来源沼液对土壤微生物碳源利用的影响

如图2所示,各土壤样品的孔平均颜色变化率随着培养时间而逐渐升高,在48 h 之前不同处理间的差异尚不明显,从72 h 开始变化规律逐渐明朗,主要表现在鸡粪沼液可引发微生物最高的碳源利用强度,牛粪沼液与对照处理较为接近,而猪粪沼液有抑制微生物碳源利用的趋势。

图3 展示了土壤微生物对六大类碳源的利用情况。微生物对碳水化合物(Car)的利用在鸡粪沼液处理中最高,显著高于猪粪沼液(P<0.05),而处于二者之间的对照和牛粪沼液处理则均与其他处理无显著差异。对于氨基酸(Ama),添加不同源沼液均有抑制微生物利用碳源的趋势,但仅在猪粪沼液处理中达显著水平(P<0.05),而后者与鸡粪和牛粪处理也无显著差异。鸡粪沼液相比其他处理显著促进了微生物对羧酸(Caa)的利用(P<0.05),这个指标在牛粪、猪粪和对照处理间并无显著差异。不同处理土壤微生物对胺类(Ami)的利用程度也可划分为3 个层次,鸡粪沼液起到了促进作用,孔颜色变化率显著高于处于第3 层次的对照和猪粪沼液(P<0.05),而后两者并无显著差异,处于中间层次的牛粪沼液处理与其他处理均无显著差异。

微生物群落的丰富度(H')和优势度指数(1/D)在不同处理间表现出一致的规律,即鸡粪沼液处理的数值最高,显著高于其他处理(P<0.05),其次为牛粪沼液处理,其数值显著高于猪粪沼液处理(P<0.05),而处于它们中间的对照处理则与二者均无显著差异(图4)。均一度指数(U)最高的也是鸡粪沼液处理,但其仅显著高于猪粪处理(P<0.05),与对照和牛粪沼液处理均无显著差异。

2.4 微生物碳代谢群落排序分析

不同沼液处理下微生物碳代谢群落的差异程度如图5所示。PCA 分析1 轴解释度为28.38%,2 轴的解释度为21.96%。总体而言猪粪沼液处理同对照的差异最大,相比而言牛粪和鸡粪沼液对微生物群落代谢的影响较小。

2.5 土壤化学性状与微生物指标的相关性分析

如表3所示,土壤理化性状同微生物碳代谢的六大类碳源存在不同程度的相关性,其中相关性最强的为氨基酸,其同土壤硝态氮、全氮、速效钾和电导率4 项均显著(P<0.05)或极显著负相关(P<0.01)。相比而言多样性指标同各理化性状不存在显著的相关性。土壤微生物量碳含量与硝态氮及速效钾呈显著负相关关系(P<0.05),而微生物生物量氮含量同pH 和电导率呈显著负相关关系(P<0.05)。

表3 土壤微生物指标与土壤化学性状相关性分析Table 3 Correlation analysis between soil microbial indices and soil chemical properties

3 讨论

施用沼液可有效提升土壤养分[5-6]。然而在本试验中,3 个沼液处理的土壤有机质含量与对照处理并无显著差异。这主要与沼液的养分特性有关。尽管沼液中有机物质丰富,但大多容易氧化分解而损失[24],且沼液中氮素以速效态为主[31-32],氮的投入促进了非自养微生物对有机碳的消耗[33],从而抵消了沼液携带有机物在土壤中的累积,这个结果与黄继川等[24]在水稻田中沼液施用后土壤有机质的表现一致。除有机质外,各沼液处理中的其他土壤养分均呈现出不同程度的升高。值得注意的是,猪粪沼液处理中硝态氮的增幅最大,其次为鸡粪沼液处理,这个结果可以由沼液中铵态氮和总氮的比率来解释。经计算,猪粪、鸡粪和牛粪沼液的铵态氮与总氮比分别为0.86、0.67 和0.24(表1),在等氮投入的条件下猪粪沼液携带的铵态氮最多,沼液进入土壤后铵态氮迅速转化为硝态氮[34],造成了猪粪沼液处理中土壤硝态氮含量最高的结果。

不同来源沼液不仅对土壤化学性状产生了显著的影响,也进一步影响了土壤中的微生物。土壤微生物量碳氮是土壤养分库中最活跃的组分,也是植物可利用营养的重要来源[35],其对有机物料的投入反映敏感[36-37],常用来指示土壤肥力[38]。此前的报道证实沼液的投入有利于提高土壤微生物量碳[2,23,39-40]。然而在本研究中,仅牛粪的土壤微生物量碳略高于对照,且未达到显著性水平。这可能与试验条件有关,以上提及的研究均为田间试验,周期较长,且有地上作物种植,本研究为室内短期培养试验,因此土壤中的生物化学过程可能同田间环境的存在较大差别[10,26]。此外,尽管氮素投入被认为是刺激土壤微生物量碳的关键因素[4],但沼液中大量铵态氮在短期内有可能起到抑制微生物生长的作用。例如曹云等[41]研究发现盆栽体系中施用沼液后土壤中细菌数量并未增长,甚至有降低趋势。在这个因素的作用下猪粪沼液造成了土壤微生物量碳的降低。相比之下,牛粪源沼液具有相对较高的碳氮比,使得更多的碳源进入土壤被微生物利用,一定程度上缓冲了抑制作用。由此可见,不同来源沼液对微生物生物量的影响存在差异。

基于微生物代谢功能的BIOLOG 微平板技术是一种常见的表征微生物群落和多样性的方法[42],广泛应用于土壤生态学研究[43]。该方法通过监测不同种类微生物对单一碳源底物利用能力的差异,从而获得土壤微生物群落结构和功能多样性的信息[44],可作为预测土壤质量变化的有力工具[45]。吸光度AWCD 值表征微生物利用碳源的整体能力[44,46]。在本研究中,与土壤微生物量碳表现相似的是,猪粪沼液处理的AWCD 值也受到了抑制,主要源于氨基酸(Ama)的降低。通过相关性分析的结果可知,Ama 的表现与猪粪沼液加入引发的土壤理化性状变化密切相关。郑学博等[25]也发现施用猪粪沼液可造成土壤微生物碳代谢强度轻微下降。相比之下,鸡粪沼液施用引发了最高的微生物碳源利用,主要与碳水化合物、羧酸和胺类的升高有关。对碳源利用的差异更清晰地呈现在PCA 上,土壤微生物代谢功能的群落结构以猪粪沼液处理产生的影响最为明显。

土壤微生物多样性与地下生态系统功能密切相关[47],高多样性往往预示着更好的土壤质量。生物多样性的指标繁多,本研究采用了常见的Shannon 丰富度、Simpson 优势度和McIntosh 均一度3 个指数[29]。Shannon 指数主要用于反映微生物群落的丰富程度;Simpson 指数与其相反,是对群落集中性的度量,并且侧重于常见种类;McIntosh 指数则基于群落物种在多维空间上距离,是对均一性的度量。三者从不同侧面评价土壤微生物群落的功能多样性[30]。关于沼液对土壤微生物多样性的影响,有的报道显示施用沼液可显著提高土壤微生物的多样性[3,41,48],也有研究发现没有显著影响[2],甚至得出相反的结果[25]。上述不一致的结果,一方面与沼液的施用量有关[25],也可能与沼液的种类和自身的特性相关。本研究中3 个指数最高值均出现在鸡粪沼液处理,反映出鸡粪沼液有利于提高土壤微生物碳代谢的多样性和均匀度,相比之下猪粪沼液表现出抑制的趋势。然而,相关性分析显示多样性指标与监测的各类土壤理化性状指标均无显著相关性。因此,尚不能判断本试验中引发处理间微生物碳代谢多样性差异的因素。沼液中成分复杂,除了含有可供植物根系和土壤生物利用的养分外,还含有可影响地下生态系统运转的微量元素、有机酸小分子,以及重金属元素等物质[16],这些指标在本研究的土壤分析中未涉及,但可能是影响微生物碳代谢的重要因子。总体上鸡粪沼液和猪粪沼液对土壤微生物碳代谢的影响表现出相反的趋势,鸡粪沼液为促进作用,而猪粪沼液呈现出抑制效应。

值得注意的是,尽管本试验采用的BIOLOG 微平板培养方法因方便快捷而受到广泛应用,但这种方法也存在着一定的局限性[49],例如其不能反映微生物休眠体,或者那些不能利用BIOLOG 碳源底物的群体的情况[29];被测试的底物不能准确地代表土壤中出现的底物类型[49]。因此,这种方法只能粗略地反映土壤微生物群体底物利用的动力学特征[49],而对微生物种类和多样性特征的呈现则相当有限。相比而言,分子生物学方法在这些方面更具有优势,宜在后续的研究中采用。此外,本研究为室内培养试验,探索的是沼液对土壤微生物的短期“激发”效应,但还不足以说明问题。沼液作为肥料资源,其农学效应、环境效应以及土壤生物学效应,更需要得到田间数据的支撑。因此,未来宜转入田间,并结合分子生物学方法开展研究,甚至可设置连续多年的试验,以明确不同来源沼液肥料对土壤生物群落的长期影响。

4 结论

1)在短期的室内培养试验中,鸡粪、牛粪和猪粪源沼液对土壤有机质含量无显著影响,但相比对照,各沼液处理对土壤无机氮、全氮、有效磷、速效钾、pH 和电导率均起到了不同程度的促进效果。

2)土壤微生物生物量碳在牛粪沼液处理中最高,而猪粪沼液中微生物量碳则同对照相比显著降低。

3)鸡粪沼液引发了微生物最高的碳源利用强度,而猪粪沼液则表现出抑制的趋势。相比其他处理,鸡粪沼液显著提高了土壤微生物的Shannon 丰富度和Simpson 优势度指数。主成分分析表明猪粪沼液处理的微生物碳代谢群落同对照的差异最大,相比而言牛粪和鸡粪沼液对微生物代谢群落的影响较小。