◎ 方周吉，张茹茹，余永康，蔡瑞鑫，张慧恩

（浙江万里学院 生物与环境学院，浙江 宁波 315100）

新鲜度是评判水产品质量优劣的重要指标，目前新鲜度的评价方法通常有感官评定法、微生物评价法、化学分析法等。各方法之间，评价结果差异较大。2014年原农业部发布了鱼类鲜度指标K值测定的水产行业标准SC/T 3048—2014，K值指标是目前衡量鱼类鲜度最常用的指标[1]。K值是以鱼体内核苷酸分解过程中产生的多种次级产物含量变化情况作为鲜度的判断依据。活体鱼类肌肉中含有大量三磷酸腺苷（ATP），鱼死后体内所含的ATP在酶和微生物的共同作用下发生分解，依次会产生二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、次黄嘌呤核苷（HxR）和次黄嘌呤（Hx）。K值是指次级产物中的次黄嘌呤核苷（HxR）、次黄嘌呤（Hx）量之和与ATP及次级产物总量的比值。K值的大小能反映核苷酸类物质在鱼体内的分解程度，是鱼类鲜度评价的重要指标，一般认为K值在20%以下的鱼为鲜度良好。测定K值需要将鱼体中6种核苷酸及次级代谢产物都测定出来。目前，K值的测定方法主要有离子色谱法、电泳法、反相液相色谱法等。其中最常用的是反相液相色谱法，反相高效液相色谱法具有操作简单、仪器普及率高等优点，水产行业标准SC/T 3048—2014鱼类鲜度指标K值的测定就是用反相高效液相色谱法测定K值。但是，传统的反相高效液相色谱法分离ATP及次级产物时，各组分之间的分离度较低，这是因为ATP及次级产物极性较大，在反相色谱柱上很难保留，分析时要在高水相条件下进行分析，这使得色谱柱对各组分缺乏了选择性，达不到完全分离的效果。而亲水性色谱（HILIC）是一种用来提高强极性物质在色谱柱上保留的技术。它采用特殊的强极性固定相，结合高比例有机相来实现强极性物质的分离分析，亲水性色谱适用于分离测定强极性化合物[2-7]。

大黄鱼是我国重要的海水养殖鱼类，养殖产量居我国海水养殖鱼类首位。大黄鱼以其肉质细嫩鲜美、蛋白质高、胆固醇低而著称。大黄鱼捕捞出水，基本已死亡，市场上大都以冰鲜销售，新鲜度很难以感官评价进行判断。因此，测定冰鲜大黄鱼鱼肉中的核苷酸及多种次级产物，以K值为指标评价大黄鱼的新鲜度是非常必要的[8]。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters 2695液相色谱仪（美国Waters公司，配置二极管阵列检测器）、JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机（宁波新芝）、5810R离心机（德国Eppendorf公司）、FE28 pH计（梅特勒）及高速组DS-1织捣碎仪（伟嘉仪器）。

1.2 材料与试剂

大黄鱼：购于宁波水产品批发市场，冰块保藏，2 h内到达实验室，-80 ℃保存。

标准品：ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP，购自源叶生物；乙腈为Fisher色谱纯；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、高氯酸、氢氧化钾为国药集团分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取

取鱼背脊上的鱼肉去皮去骨后，均质，称取5.00 g，放入50 mL离心管中，加入预冷的高氯酸溶液（10%）20 mL，超声波细胞粉碎机提取10 min。8 000 r·min-1，4 ℃离心20 min，取出上清液。再用10 mL高氯酸溶液（10%）提取沉淀物，离心，合并上清液，用KOH溶液调pH至6.5，用流动相定容至50 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，待上机。

1.3.2 标准曲线制作

用流动相配制标准工作溶液，ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP每种标样的浓度梯度为5.0 μmol·L-1、10.0 μmol·L-1、20.0 μmol·L-1、50.0 μmol·L-1、100.0 μmol·L-1和200.0 μmol·L-1，进样量20 μL，上机测定，以峰面积与浓度作标准工作曲线。

1.3.3 色谱条件

亲水性色谱柱：BEH Amide（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A 2.0 mmol·L-1磷酸二氢钾，B乙腈；洗脱方式：等度洗脱，A 20%，B 80%；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃，检测波长：254 nm；进样量：20 μL。以组分保留时间定性，以峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

流动相的确定，以不同浓度磷酸二氢钾溶液（0.5 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、3.0 mmol·L-1、5.0 mmol·L-1）作为流动相，测定ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP的分离情况。磷酸二氢钾的浓度主要影响流动相的pH值，分析物的解离程度受流动相pH影响很大，在色谱分析过程中，只有当ATP等物质以分子形式存在时，才能在色谱分离中得到较好的峰形和分离情况。实验表明，当磷酸二氢钾浓度在2.0 mmol·L-1时能够使ATP等物质解离抑制，大部分以分子形式存在。在亲水性色谱中，流动相中水相比例越高，洗脱能力越强，这与传统反相色谱刚好相反，流动相中含有大量的有机相，使亲水性色谱的选择性提高。实验表明，水相比例在20%时，各物质之间能够得到较好的分离。因此，流动相的组成选择为2.0 mmol·L-1磷酸二氢钾∶乙腈为20∶80。ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP保留时间分别为14.73 min、12.71 min、10.89 min、6.21 min、7.62 min和11.63 min。亲水性色谱与标准SC/T 3048—2014中反相色谱的出峰顺序不同，各物质分离度提高[1]。

2.2 线性回归、检出限及定量限

实验对6种化合物进行外标法定量，制作回归曲线，得到相关系数。以6种化合物的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，得到回归方程及相关系数，并确定方法检出限（S/N）＞3和定量限（S/N）＞10，结果见表1。可知6种物质均呈现良好的线性关系。色谱图见图1和图2。

表1 回归方程、线性相关系数、检出限和定量限表

图1 标样色谱图

图2 大黄鱼样品色谱图

2.3 加标回收率及精密度实验

将标准品加入到5.00 g样品中，配制成高2.0 μmol·g-1、中0.5 μmol·g-1、低0.2 μmol·g-1的3个浓度加标量，进行样品提取和色谱分析，每个加标量做3个平行，计算回收率。由表2可见，本方法对6种化合物的回收率均在90.2%～106.3%，相对标准偏差在0.8%～4.2%，重现性和精密度较好。

表2 加标回收率和精密度表（n=3）

（续表2）

3 结论

对水产品中ATP及关联产物的测定，现行有效的行业标准SC/T 3048—2014采用反相色谱分析法，使用纯水相作为流动相，各物质之间很难完全分离。本研究利用亲水性色谱对ATP及关联产物进行分析，亲水性色谱使用较高含量的有机相作为流动相，使色谱柱对各物质的保留特性有较大的差异，使各物质得到较好的分离，得到较好的效果。此方法简单、准确、回收率高、精确度高。