战翔宇，孙玉鸿，陈 瑞，赵 阳，张东瑞，薛 嵩，刘 佳，隋洪玉

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最严重和常见的慢性并发症之一，也是糖尿病患者的主要死因之一[1]，其早期病理改变主要为肾脏肥大。肾脏肥大是由于细胞的肥大和增生联合所致，其机制涉及许多因素，诸如血流动力学、高血糖、细胞因子、氧化应激、代谢因素及某些特异基因表达等，其中细胞因子起着非常重要的作用[2,3]。研究显示，TNF-α与糖尿病的发生、发展密切相关[4]，但它是否参与了DN中肾脏肥大的形成过程鲜有报道。本研究旨在探讨TNF-α对糖尿病肾病大鼠肾脏肥大的影响，以期为糖尿病肾病的早期防治提供新的理论依据和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD (Sprague- Dawley)大鼠，体质量180～220g，由佳木斯大学实验动物中心提供。

1.2 实验材料

链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)由Sigma公司提供，TNF-α抗体由Abcam公司提供，Actin-β由Affinity公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及处理

取32只SD雄性大鼠(200～250g)，适应性喂养1周，禁食10h后，随机平均分成4组，分别为：正常组(NC，n=8)、糖尿病模型组(DM，n=8)、正常+TNF-α阻断剂组(NC+TNFR:Fc，n=8)、糖尿病+TNF-α阻断剂组(DM+TNFR:Fc，n=8)。DM组腹腔注射链脲佐菌素(STZ，60mg/kg)造模；NC组腹腔注射与DM组等量的柠檬酸缓冲液作为对照；NC+TNFR:Fc组腹腔注射与DM组等量的柠檬酸缓冲液，并在注射前一天皮下注射TNFR:Fc(2mg/kg)，以后按周2次注射TNFR:Fc至3周；DM+TNFR:Fc组腹腔注射STZ，并在注射STZ前一天皮下注射TNFR:Fc(2mg/kg)，以后按周2次注射TNFR:Fc至3周。

1.3.2 Western blot技术

取50μg蛋白样品上样后进行聚丙烯酰胺电泳，电泳结束后进行转膜(200mA, 1h)，5%脱脂奶粉溶液室温下封闭1h后进行一抗孵育并4℃过夜，TBST溶液洗膜(4×10min)，室温下二抗孵育1h，TBST溶液洗膜(4×10min)，ECL发光液显影后进行凝胶成像分析。

1.3.3 ELISA技术

加入50μL标准品及检测样本至反应孔中，再加入50μL的相应抗体至所有孔，封板后室温下孵育1h，洗液洗板3次后加入100μL 显色底物至所有反应孔中并孵育10min，加入100μL停止液后立即用酶标仪450nm波长下测量OD值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 空腹血糖及24 h尿白蛋白变化

在实验72h和3周时检测大鼠空腹血糖，3周实验结束时检测24h尿白蛋白排泄量。结果显示：与NC组相比，DM组空腹血糖明显升高(P<0.01)；与NC组相比，DM组24 h尿白蛋白排泄量明显升高(P<0.01)。结果表明糖尿病肾病模型制备成功。见表1。

表1 大鼠空腹血糖及24h尿白蛋白变化

2.2 肾组织中TNF-α蛋白表达变化

应用Western blot法检测肾组织中TNF-α的蛋白表达,见图1。结果显示：与NC组相比，DM组肾组织中TNF-α的蛋白表达明显升高(n=3,P<0.01)。

图1 大鼠肾组织中TNF-α的蛋白表达

2.3 TNF-α对糖尿病大鼠肾脏肥大的影响

3周实验结束时，立即取出大鼠双侧肾脏并称重，通过肾湿重/体重计算肾指数。结果显示：与NC组相比，DM组肾指数明显升高(n=8,P<0.01)；与DM组相比，DM+TNFR:Fc组肾指数下降(P<0.05)。见表2。

表2 TNF-α对糖尿病大鼠肾指数的影响

3 讨论

糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，已成为威胁人类健康的重大公共卫生问题之一。据统计，2019年全球约有4.63亿糖尿病患者，中国糖尿病患者约为1.164亿，位居世界首位，国际糖尿病联合会预测2035年全球糖尿病患者人数将增至5.52亿，这意味着每年将近增加一千万新糖尿病患者。糖尿病引起的各种急慢性并发症，致残、致死率高，严重影响患者的生活质量及寿命，造成巨大的家庭和社会经济负担，而糖尿病肾病是糖尿病最严重的并发症之一，亦是诱发终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)最常见的原因，其已成为不可忽视的社会经济问题[5]。

目前普遍认为DN是一种具有慢性、轻微等特征的“微炎症”疾病[6,7]，主要表现为以巨噬细胞为主的炎症细胞的激活以及各种与炎症相关的炎性细胞因子在患者肾组织中的聚集。研究显示，高血糖、脂质代谢异常及肾脏血流动力学的改变等均可刺激炎性细胞因子的产生，加重肾脏组织损伤，促进DN的发生与发展[8,9]。肿瘤坏死因子是一种具有多种生物活性的炎性细胞因子，包括TNF-α及TNF-β两类。TNF-α主要由活化的单核细胞、巨噬细胞产生，也可由中性粒细胞、内皮细胞、平滑肌细胞产生。在肾脏，TNF-α主要是由系膜细胞、肾小管上皮细胞等产生。TNF-α与众多炎性因子共同参与到DN形成的病理过程中，在DN的发病机制中担当重要角色。TNF-α可直接对肾脏细胞造成细胞毒性，诱发肾损伤、凋亡和细胞坏死等；TNF-α可提高系膜细胞单核细胞趋化蛋白的分泌、聚集，刺激肾小球细胞增殖；还可诱导肾脏系膜细胞产ROS，改变肾小球血管壁的形态和结构，增加滤过膜的通透性，产生蛋白尿，但是否参与到DN肾脏肥大的形成中尚未明确。本实验采用Western blot等技术观察了糖尿病肾病大鼠模型肾组织中TNF-α的蛋白表达，以及TNF-α对肾指数的影响，结果显示，DN大鼠肾组织TNF-α蛋白水平及肾指数显著上升，而给予其阻断剂后肾指数下降，说明TNF-α促进了糖尿病大鼠肾脏肥大的形成，但其形成机制尚需探讨，在以后的实验研究中将进一步寻找TNF-α促进肾脏肥大是通过何种信号转导通路实现的。本实验结果为探明TNF-α对糖尿病性肾脏肥大形成机制积累了一定的理论依据，亦为DN的靶向治疗提供了新的作用靶点。