柏建学，柴发永，范锋

(1.山东省食品药品审评查验中心，山东 济南 250014；2.辰欣药业股份有限公司，山东 济宁 272073)

甲磺酸达比加群酯(Dabigatran Etexilate Mesylate)是由德国勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)公司研制开发的一种新型口服抗凝药物，属于可逆的、竞争性的直接凝血酶抑制剂，欧洲药品管理局(EMEA)于2008年批准其在欧盟上市[1-2]。其化学式为β-丙氨酸，N-[[2-[[[4-[[[(己氧基)羰基]氨基]亚氨基甲基]苯基]氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基]羰基]-N-2-嘧啶-，乙酯，甲磺酸盐，化学结构式见图1。

本品的合成、精制工艺中用到了甲磺酸、乙醇和异丙醇，故本品中有甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸异丙酯(IMS)产生的可能。EMEA明确规定甲基磺酸酯类杂质为遗传毒性杂质，必须严格控制。参照EP8.0版附录中“Methyl,Ethyl and Isopropyl Methanesulfo Nate in Active substances”[3]和相关文献[4-5]，采用GC-MS法直接对本品中3种甲磺酸酯进行检测，为甲磺酸达比加群酯原料中甲磺酸酯的控制提供了有效的分析手段。

1 仪器与试药

6890N-5973N型气相色谱-质谱联用仪(Agilent，USA)，COMBI-PAL型顶进样器(CTC，Switzerland)；Mettler Toledo XS205电子天平；SK8200LH数控超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

甲磺酸甲酯对照品(批号：A0338199，含量：99.0%，ACROS)，甲磺酸乙酯对照品(批号：10169291，含量：97.0%，Alfa Aesar)，甲磺酸异丙酯对照品(批号：B001983389，含量98.0%，Aldrich)，甲磺酸正丁酯对照品(批号：P23O，含量：99.0%，Matrix Scientific)；甲磺酸达比加群酯原料(批号：140301、140302、140303，山东新时代药业有限公司)；二氯甲烷(色谱纯，J.T.Baker)。

2 方法与结果

2.1 GC-MS条件

2.1.1 GC条件 采用DB-624色谱柱(30 m×0.25 mm,1.4 μm)；柱温采用程序升温：起始温度100 ℃，以15 ℃·min-1的速率升温至200 ℃，再以25 ℃·min-1的速率升温至240 ℃；进样口温度为220 ℃；不分流；载气为高纯氦气(99.999%)；流速为1.0 mL·min-1；进样量为2.0 μL。

2.1.2 MS条件 EI离子源；离子源温度为230 ℃，电子能量为70 eV；采集模式为SIM。各杂质质谱定量/定性离子峰见表1。

表1 各杂质质谱定量/定性离子峰

2.2 稀释溶剂的选择 取本品和甲磺酸酯杂质，采用甲醇、乙腈、异丙醇和二氯甲烷等溶剂进行试验，结果表明，二氯甲烷效果最佳，故选择二氯甲烷作为本品中甲磺酸酯检测的稀释溶剂。

2.3 溶液配制

2.3.1 内标溶液 精密称定甲磺酸丁酯(BMS)10.8 mg，置玻璃小瓶中，准确加入二氯甲烷1.08 mL，摇匀；精密量取1.0 mL，置100 mL量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀；精密量取0.1 mL，置50 mL量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，作为内标溶液(浓度为200 ng·mL-1)。

2.3.2 对照品溶液 精密称定MMS对照品10.6 mg，置玻璃小瓶中，准确加入二氯甲烷1.06 mL，作为MMS对照品溶液(浓度为10 mg·mL-1)；精密称定EMS对照品10.5 mg，置玻璃小瓶中，准确加入二氯甲烷1.05 mL，作为EMS对照品溶液(浓度为10 mg·mL-1)；精密称定IMS对照品10.3 mg，置玻璃小瓶中，准确加入二氯甲烷1.03 mL，作为IMS对照品溶液(浓度为10 mg·mL-1)。精密量取上述3种对照品溶液各1.0 mL，置100 mL量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液(浓度为100 μg·mL-1)；精密量取0.1 mL，置50 mL量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(浓度为200 ng·mL-1)。

2.3.3 供试品溶液 取甲磺酸达比加群酯原料约100 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，精密加入内标溶液2.0 mL，加二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 系统适用性 取内标溶液和混合对照品溶液各1.0 mL，置10 mL量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，精密量取2.0 μL进行气质分析，记录离子流图，质谱扫描模式为Scan模式，经过质谱分析得出4种成分的保留时间。结果见图2。结果表明，MMS、EMS、IMS和BMS保留时间分别为4.469、5.172、5.473和7.211 min，各成分峰的理论板数均大于10 000，各成分之间的分离度均大于2.0，且空白溶剂(二氯甲烷)对甲磺酸酯检测无干扰。

图2 系统适用性的MS图

另精密量取对照品溶液和内标溶液各0.2 mL，置进样瓶中，用二氯甲烷稀释至1.0 mL，连续进样6次，结果见表2。结果表明，各成分峰面积的RSD均小于2.0。

表2 系统适用性结果

2.5 线性关系与范围 精密量取对照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL，分别置10 mL量瓶中，分别精密加入内标溶液2.00 mL，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，分别依法测定，记录总离子流图，量取峰面积。以目标物峰面积与内标峰面积的比值为横坐标，以相应目标物浓度为纵坐标进行线性回归，结果见表3。

表3 线性关系与范围试验结果

2.6 精密度 精密量取对照品溶液和内标溶液各0.2 mL，置进样瓶中，用二氯甲烷稀释至1.0 mL，配制6份，分别精密量取2.0 μL，注入气质联用色谱仪，记录总离子流图，量取峰面积，计算杂质与内标的比值及相对标准偏差(RSD)，结果见表3。结果表明，杂质与内标比值的RSD均小于2.0，说明本方法精密度良好。

表4 精密度试验结果

2.7 中间精密度 取本品(批号：140301)和内标溶液，依法测定6份，按内标法计算杂质的含量，并计算相对标准偏差(RSD)，结果见表5。结果表明，MMS和IMS均未检出，EMS为0.031 ppm，RSD为6.77%。说明本方法重现性良好。

表5 中间精密度试验结果

2.8 回收率 取本品(批号：140301)约100 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，精密加入内标溶液各2.0 mL，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白校样品溶液。另取本品(批号：140301)约100 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，精密加入对照品溶液和内标溶液各2.0 mL，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为100%浓度的供试品溶液(40 ng·mL-1)，同法配制200%浓度的供试品溶液(80 ng·mL-1)和50%浓度的供试品溶液(20 ng·mL-1)，每个浓度平行制备3份。精密量取空白样品溶液2.0 μL，注入气质联用色谱仪，记录离子流图，扣除样品中的检出量，计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表6。由结果可知，MMS、EMS和IMS的平均回收率分别为96.98%、97.91%、96.57%，RSD分别为2.34%、2.93%、1.77%，说明回收率较高，准确度较好。

表6 回收率试验结果

2.9 定量限 通过逐级稀法配制定量限溶液，按信噪比S/N≈10的溶液浓度为定量限溶液，精密量取2.0 μL，注入LC-MS，连续测定6次。结果表明，MMS、EMS和IMS的定量限均为5 ng·mL-1(0.5 ppm)。

2.10 检出限 按信噪比S/N≈3的溶液浓度为检出限溶液，精密量取2.0 μL，注入气质联用色谱仪，连续测定6次。结果表明，MMS、EMS和IMS的检出限均为1.5 ng·mL-1(0.15 ppm)。

2.11 样品测定 取本品3批样品(批号：140301、140302、140303)，依法测定，结果见表7。结果表明，3批样品中MMS和IMS均未检出，EMS均小于0.1 ppm。

表7 3批样品中甲磺酸酯的检测结果

3 讨论

烷基(或苯基)磺酸酯可与DNA发生烷基化反应，从而可能成为引发癌症的诱因，对人类的健康造成极大威胁，因此，必须严格控制药品中的烷基(或苯基)磺酸酯的限度[6]。根据《遗传毒性杂质限度指导原则》相关规定，采用毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern，TTC)作为控制遗传毒性杂质限度的方法。对于无阈值效应的遗传毒性杂质，如果每日摄入量低于1.5 μg，则可忽略不计患者因服药导致癌症发生的额外风险[7-9]。按照本品日最大服用量300 mg计算，甲磺酸酯(MMS、EMS和IMS)的限度应不得大于5 ppm。本方法的灵敏度、线性和范围、准确度和重现性完全满足本品中甲磺酸酯的检测要求。