徐宇琴 陈燕 傅真杰 温成平 陈宜涛

浙江中医药大学 杭州 310053

自2019年12月以来，由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2，SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在武汉暴发，目前仍在全球蔓延。该病毒具有极强的传染性，据世界卫生组织统计，截至2020年11月30日，全球累计COVID-19确诊病例超过6 219万，死亡人数超145万。虽然研究发现，SARS-CoV-2与其他冠状病毒有相似之处，但目前对于SARSCoV-2的致病途径以及潜在药物靶点仍缺乏充分了解，也无抗SARS-CoV-2的特效药物。中医药在COVID-19的治疗上全方位地发挥了重要作用，改善了患者的临床症状，提高了患者存活率。

连花清瘟胶囊由中药连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天、薄荷脑和甘草组成，常用于治疗流行性感冒，具有抗炎、止咳化痰、广谱抗病毒的作用[1]。体外实验发现，连花清瘟胶囊可以抑制SARS-CoV-2的增殖，减少细胞因子的过度激活[2]，从而能够明显缓解COVID-19患者的临床症状。同时，临床研究表明，连花清瘟胶囊能够有效缓解COVID-19患者发热、乏力、咳嗽等症状，减轻肺部炎性损伤，增加COVID-19的治愈率[3]。基于连花清瘟胶囊确切的基础实验和临床研究证据，国家药监局批准连花清瘟胶囊/颗粒增加治疗“新型冠状病毒肺炎轻型、普通型”的新适应证。到目前为止，连花清瘟胶囊抗COVID-19的药理机制仍不清楚，需要进一步深入研究。基于目前的研究成果，本研究运用公共数据库和高通量技术分析预测药物的药理学机制，初步预测和分析连花清瘟胶囊治疗COVID-19的成分、靶点和通路，为后续有效药物的研发提供理论支持。

1 资料和方法

1.1 连花清瘟胶囊活性成分筛选 通过中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）检索连花清瘟胶囊中药物连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、板蓝根、鱼腥草、广藿香、大黄、薄荷脑、甘草的化学成分，通过文献索引查找TCMSP中无记载的石膏、绵马贯众和红景天的化学成分。通过口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug likeness，DL）预测化合物的成药性。OB是衡量药物体内代谢动力学过程的重要参数，能够有效预测药物在体内的生物利用度。DL指化合物与已知药物的相似性，是化合物成药的评价指标。根据连花清瘟胶囊中成分的数量及相应OB值、DL值，参考其他中药有效成分筛选条件，最终以OB≥30%和DL≥0.18为筛选标准，筛选出成药性较高的化合物。

1.2 药物作用靶点获取 通过TCMSP检索候选化合物的靶点。在蛋白质数据库UniProt（https://sparql.uniprot.org/）中获取人类基因信息，通过比对人类基因信息，将TCMSP中获取的靶点名称转化为相应的基因名称。

1.3 COVID-19相关靶点筛选 在人类基因组注释数据库（Human Genome Annotation Database，Gene Cards）中检索COVID-19的相关靶点，关键词选择“novel coronavirus pneumonia”“severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2（SARS-CoV-2）”和“corona virus disease 2019（COVID-19）”，对三个基因集合进行整合，并去除重复基因，得到COVID-19的潜在靶点。

1.4 连花清瘟胶囊治疗COVID-19主要靶点筛选 利用Venn在线平台Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集，找到两者的共同靶点。将共同靶点导入String在线平台数据库 （https://string-db.org/），构建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络。 将PPI数据导入Cytoscape中，使用MCODE插件进行基因网络拓扑结构分析，依据节点连接度（degree）、节点介度（betweenness centrality，BC） 和节点紧密度 （closeness centrality，CC）这3个网络拓扑参数，筛选出核心靶点，进一步对核心靶点构建PPI网络。

1.5 连花清瘟胶囊治疗COVID-19的功能和通路富集分析 将1.4中筛选得到的核心靶点导入Metascape在线数据库（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1），以人类为研究对象，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。设置P＜0.01，筛选主要的生物功能和通路，采用绘图软件GraphPad Prism 7.0将GO功能分析结果可视化，采用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/login/）将KEGG通路富集分析结果可视化。

1.6 连花清瘟胶囊主要“有效成分-核心靶点”网络构建 将核心靶点与连花清瘟胶囊中有效成分的靶向关系导入Cytoscape软件，构建“有效成分-核心靶点”网络，并进行拓扑分析，以degree值为标准，筛选主要有效成分，即为连花清瘟胶囊治疗COVID-19的主要有效成分。

2 结果

2.1 连花清瘟胶囊活性成分和作用靶点 以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，在连花清瘟胶囊各味中药中共获得260个活性成分，其中金银花23种、连翘23种、广藿香11种、苦杏仁19种、麻黄23种、鱼腥草7种、板蓝根39种、大黄中16种、甘草93种、红景天3种、绵马贯众3种，去除重复后共得到184种活性成分。根据所得活性成分，检索TCMSP数据库，共得到255个作用靶点。见表1。

表1 通过OB和DL筛选出的“连花清瘟胶囊”中的活性成分Tab.1 Active components screened by OB and DL in “Lianhua Qingwen Capsule”

2.2 COVID-19相关靶点以“Novel Coronavirus Pneumonia”为关键词检索得到438个靶点，检索“severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2（SARS-CoV-2）”得到237个靶点，检索“corona virus disease 2019（COVID-19）”得到64个靶点，剔除重复后共得到587个COVID-19相关的靶点。

2.3 连花清瘟胶囊治疗COVID-19主要靶点 通过Venn在线平台对连花清瘟胶囊活性成分的255个靶点与COVID-19的587个靶点取交集，共获得65个共同靶点。见图1。将所获靶点导入String平台构建PPI网络，Cytoscape分析此PPI网络数据，经计算该网络的平均degree为7.2，平均BC值为0.0058，平均CC值为30.74，筛选得到血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、肿瘤抗原p53（tumor antigen p53，TP53）、 白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等23个靶点的degree值、BC值、CC值均大于该网络的相应平均值，提示这些靶点可能是连花清瘟胶囊治疗COVID-19的核心靶点。

图1 连花清瘟胶囊活性成分靶点与COVID-19相关靶点关系的Venn图Fig.1 Venn diagram of the relationship between the effective component target of Lianhua Qingwen Capsule and COVID-19 related target

对这23个核心靶点构建PPI网络，网络中共有23个节点，492条边，节点大小反映degree值大小变化，节点越大degree值越大；边的粗细反映combined score值大小变化，边越粗combined score值越大。见图2。将23个靶点导入Metascape数据库，获得靶点对应的蛋白功能。见表2。

图2 连花清瘟胶囊治疗COVID-19靶点的PPI网络图Fig.2 The diagram of PPI network among targets of Lianhua Qingwen Capsule in the treatment of COVID-19

表2 连花清瘟胶囊治疗COVID-19核心靶点的蛋白功能Tab.2 Protein function of core targets of Lianhua Qingwen Capsule in the treatment of COVID-19

2.4 连花清瘟胶囊治疗COVID-19的功能和通路 GO功能富集分析提示，生物过程（biological process，BP）主要涉及对有毒物质、无机物、脂多糖、抗生素、药物的反应，对神经元死亡、白细胞迁移、细胞黏附的调节，以及外部凋亡信号通路、活性氧代谢等；细胞组成（celluar component，CC）主要包括膜筏、黏着连接、核被膜、转录因子复合体、质膜蛋白复合体、谷氨酸能突触和线粒体包膜；而分子功能（molecular function，MF）主要涉及细胞因子受体、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK） 活性、肿瘤坏死因子受体、激酶调节、G蛋白偶联受体结合等功能。见图3。

图3 连花清瘟胶囊治疗COVID-19潜在靶点的GO功能分析Fig.3 GO function analysis of potential targets of Lianhua Qingwen Capsule in the treatment of COVID-19

KEGG通路富集分析显示，连花清瘟胶囊治疗COVID-19涉及的通路主要集中于肿瘤和病毒感染通路，包括晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体（advanced glycosylation end product-receptor of AGE，AGE-RAGE）信号通路、南美锥虫病、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、癌症通路、人类T细胞白血病病毒1感染、EB病毒感染、FoxO信号通路、酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录活化蛋白（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信号通路等。见图4。

图4 连花清瘟胶囊治疗COVID-19潜在靶点的KEGG富集分析Fig.4 Enrichment analysis of KEGG of potential targets of Lianhua Qingwen Capsule in the treatment of COVID-19

2.5 连花清瘟胶囊“中药-主要有效成分-核心靶点”网络 通过Cytoscape匹配核心靶点和连花清瘟胶囊的有效成分，共得到71种有效成分。进一步通过网络拓扑分析，以degree值大于均值为标准筛选有效成分，得到22个主要有效成分，其中槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山奈酚、甘草查尔酮A和柚皮素对应的靶点数大于4个，是发挥抗COVID-19作用的重要有效成分。根据中药、有效成分及作用靶点网络提示，中药与主要有效成分及靶点间存在复杂的多靶点网络联系，黄色节点表示中药，蓝色节点表示药物有效成分，红色节点表示核心靶点，边表示有效成分与靶点的相互作用。见图5。

图5 “中药-主要有效成分-核心靶点”关系网络Fig.5 “Active components-core targets” network

3 讨论

中医学理论认为COVID-19属于 “湿毒疫”范畴[4-5]，主要证候是湿、热、毒、虚、瘀，临床症状以发热、干咳、乏力为主。临床研究发现，SARS-CoV-2主要侵袭肺脏、脾脏、心脏和血管等靶器官[6]，COVID-19患者的病理检查结果显示肺脏和免疫系统为主要受损点[7]。连花清瘟胶囊具有广谱抗病毒、抗感染、免疫调节作用，对多种冠状病毒感染的病症均有良好治疗作用[8-9]。本研究从连花清瘟胶囊中筛选得到184种活性成分，潜在靶点255个，与COVID-19的交集靶点65个。

网络拓扑分析提示，连花清瘟胶囊的活性成分主要通过作用于VEGFA、MAPK3、TP53、IL-6、MAPK1、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等23个核心靶点以发挥治疗COVID-19的作用。SARS-CoV-2感染机体后，诱发过度的自身免疫反应，释放IL-6、干扰素-γ（interferon-γ，INF-γ）、TNF-α、单核细胞趋化因子-1 （monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等大量炎症因子，导致免疫调控网络失衡[10]。因此，抗炎治疗是治疗COVID-19的重要手段。在核心靶点中，IL-6、TNF、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）等是促炎因子，据此推测连花清瘟胶囊可能通过抑制SARSCoV-2感染所致的炎症反应来发挥疗效。COVID-19患者会出现心衰、心梗、心律失常等心血管系统并发症[11]，VEGFA、IL-6、TNF、IL-10、CC类趋化因子配体2（C-C motif ligand 2，CCL2）等核心靶点又是心血管疾病相关基因，这提示连花清瘟胶囊还可能在一定程度上治疗COVID-19患者心脏、血管等靶器官的损伤。综上所述，通过对靶点的功能分析，提示连花清瘟胶囊可能通过调节靶点炎症因子表达，从而抑制炎症反应；同时通过调控心血管疾病相关基因，治疗心脏、血管等靶器官的损伤。

KEGG通路富集分析结果显示，核心靶点涉及最多的疾病信号通路是病毒感染相关通路，包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类T细胞白血病病毒1感染、EB病毒感染、单纯疱疹病毒感染等信号通路，表明连花清瘟胶囊可能对病毒感染有一定的功效。

针对所筛选的23个核心靶点，本研究进一步挖掘出连花清瘟胶囊治疗COVID-19的22个主要有效成分。化合物靶点分析发现了6个有效成分对应的靶点数大于4个，分别为槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山奈酚、甘草查尔酮A和柚皮素。研究已证实，槲皮素和山奈酚能通过调控MAPK信号通路抑制炎症反应[12-13]；槲皮素、山奈酚和汉黄芩素能显著抑制STAT3的激活和VEGF的表达，具有抗炎和调控血管生成的作用[12-14]；山奈酚可以减低ICAM-1和TNF-α水平，防止动脉粥样硬化[15]，保护心血管系统；槲皮素、山奈酚、木犀草素和甘草查尔酮A均能降低促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β的水平，进而抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，以减轻炎症反应[12-13，16-17]；柚皮素可显著减低TNF-α、转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）、NF-κB的水平，从而抑制炎症反应，并能够有效缓解肺损伤[18]。由上可知，连花清瘟胶囊中筛选出的主要有效成分具有显著的抗炎作用，可能是干预COVID-19引发的炎症反应的物质基础。

进一步研究发现，上述有效成分广泛存在于甘草、金银花、连翘、麻黄、广藿香、鱼腥草、红景天、板蓝根和大黄9味药中。连翘、金银花和红景天均归心、肺经，具有抗炎、调节免疫功能的功效[19-21]。麻黄归肺经，有抗炎和抑制流感病毒的作用[22]。鱼腥草归肺经，具有镇咳平喘、化痰祛湿、增强机体免疫的功能[23]。甘草与广藿香归脾、肺经，功效祛湿化浊，能抗炎、调节免疫、健脾和改善肺功能[24-25]。板蓝根与大黄分别归脾经和心经，能够抗炎、提高免疫力及保护心脑血管[26-27]。

连花清瘟胶囊中的石膏为矿物药，是以无机化合物为主要成分的一类药物，由于无机化合物在TCMSP数据库中无对应靶点，故未将石膏纳入成分靶点筛选。石膏被广泛运用于临床治疗，其主要成分是含水硫酸钙，还含有少量锌、铁、镁等微量元素。钙离子是人体内含量最多的金属元素，几乎参与机体所有的生理活动过程，是维持机体细胞正常功能非常重要的离子。石膏中所含的部分其他无机元素亦是人体必需的微量元素，这些以钙离子为主的无机元素是石膏发挥药理作用的基础，也是石膏药用功效广泛的原因。研究证实，石膏对炎症及心血管系统、免疫系统的相关病症均具有一定的治疗作用[28]。

本研究通过网络药理学对连花清瘟胶囊的作用机制进行分析，结果表明，连花清瘟胶囊通过综合调节多个靶点，发挥潜在的治疗作用，其作用主要涉及调控炎症因子、调节心血管疾病的相关通路、抗病毒等，体现了中药多成分、多靶点、多通路协同的作用机制。本研究初步阐明了连花清瘟胶囊治疗COVID-19的主要有效成分、核心靶点和通路之间的相互关系，对其治疗COVID-19的靶点和通路进行了初步预测和分析，以期为后续实证研究和药物研发提供理论依据。随着对COVID-19致病靶点研究的深入，笔者团队将进一步探索连花清瘟胶囊治疗COVID-19的作用机制。

（致谢：本文在浙江中医药大学中医临床基础研究所完成，感谢全体实验室人员对文章相关工作的指导和建议!）