求鑫瑜 楼招欢

1.浙江中医药大学药学院 杭州 311402 2.宁波市妇女儿童医院

乌药（Linderae Radix）系樟科植物乌药（Lindera aggregata（Sims） Kosterm.）的干燥根，现主要分布于浙江天台、衢州，江西景德镇、抚州、新余，湖南怀化、邵阳和四川巴中等地区。现代药理研究显示，乌药具有调节胃肠道功能的作用[1]。天台被认为是乌药的道地产区，天台乌药的药材品质和疗效与其他产地乌药相比有着显著的优势，这种优势或称为“道地性”是否与其生长的地理环境及由此产生的活性成分差异相关，目前尚未得知。研究表明，产地不同、生长的环境存在差异，可引起药材性状及所含有效成分的改变，进而影响药材的有效性[2-3]。特征性、指标性成分含量的高低是评价药材品质好坏的重要标准；而药材的显微特征观察示例可用于中药真伪鉴定和药材优劣评价，是道地药材鉴别的有效方法[4-5]。乌药醚内酯与去甲异波尔定是乌药的法定检测指标[6]，其中乌药醚内酯亦是其特征性成分[7]。本研究采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 法检测道地与非道地产区乌药去甲异波尔定、乌药醚内酯2个主要成分的含量并观察药材显微特征，探讨地理分布与乌药药材“道地性”的相关性，寻找道地产区乌药的独特综合性指标，拟阐释乌药“道地性”的科学内涵[8]，为乌药进一步开发利用提供参考。

1 仪器和材料

1.1 材料 去甲异波尔定对照品、乌药醚内酯对照品均购于上海源叶生物科技有限公司 （批号：P10M9L61140、ZJ0630BA14）；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）均购于O-ceanpak公司（批号：20111102G108、20111027G108）；甲醇（分析纯）、甲酸（分析纯）、盐酸（分析纯）均购于国药集团化学试剂有限公司（批号：20200928、20160516、20191216）；甲酸（色谱纯）购于Aladdin公司（批号：E2022005）。浙江天台、湖南怀化产地乌药药材由浙江中医药大学中药饮片厂提供，浙江衢州、江西景德镇、湖北恩施产地乌药药材由宁波市鄞州医药药材有限公司提供，云南楚雄产地乌药药材由云南螺蛳湾药材批发市场采购，天台乌药样品在产地经刮皮处理，余产地样品为原药材干燥后所切饮片。

1.2 主要仪器 LC-20A型岛津高效液相色谱仪购于日本岛津公司；BSA224S型Sartorius电子天平为德国Sartorius公司产品；XS105DU型电子天平购于瑞士Mettler Toledo公司；SB-5200D超声波清洗机购于宁波东南仪器有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱购于上海精宏实验设备有限公司；DM500正置显微镜为徕卡仪器（德国）有限公司产品。

1.3 乌药醚内酯、去甲异波尔定含量测定

1.3.1 色谱条件

1.3.1.1 乌药醚内酯含量测定 Silversil C18柱（4.6nm×250nm，5μm），流动相乙腈:水（56:44），柱温30℃；流速1.0mL·min-1，检测波长235nm，进样量10μL，理论塔板数不低于2 000。

1.3.1.2 去甲异波尔定含量测定 Silversil C18柱（4.6nm×250nm，5μm），流动相为乙腈（A）:含0.5%甲酸、0.1%三乙胺溶液（B），梯度洗脱（0～13min，10%～22%A，13～22min，22%A），柱温30℃，流速1.0mL·min-1，检测波长280nm，进样量10μL，理论塔板数不低于5 000。

1.3.2 对照品溶液的制备

1.3.2.1 乌药醚内酯对照品溶液的制备 精密称取乌药醚内酯对照品7mg，称定质量，置于50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得0.144mg·mL-1的乌药醚内酯对照品溶液。

1.3.2.2 去甲异波尔定对照品溶液的制备 精密称取去甲异波尔定对照品11mg，称定质量，置于50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得0.220mg·mL-1的去甲异波尔定对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备

1.3.3.1 乌药醚内酯含量测定供试品溶液制备 精密称取乌药粉末0.250g，过3号筛，置于25mL具塞锥形瓶中，加甲醇至刻度，超声1h，冷却，以甲醇补足至刻度线，过0.45μm微孔滤膜，即得乌药醚内酯供试品溶液。

1.3.3.2 去甲异波尔定含量测定供试品溶液制备 精密称取乌药粉末0.100g，过3号筛，置于具塞锥形瓶中，以移液管移取甲醇-盐酸（0.5→100）（2:1）25mL，称定质量，加热回流并保持微沸1h，冷却，再称定并补足质量，摇匀，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得去甲异波尔定供试品溶液。

1.3.4 精密度考察

1.3.4.1 乌药醚内酯精密度考察 精密称取同一批次乌药粉末，按照1.3.3.1项条件提取，1.3.1.1项色谱条件进样，连续进样6次，记录各峰面积（mAU×min），计算6次进样峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.4.2 去甲异波尔定精密度考察 精密称取同一批次乌药粉末，按照1.3.3.2项条件提取，1.3.1.2项色谱条件进样，连续进样6次，记录各峰面积（mAU×min），计算6次进样峰面积的RSD值。

1.3.5 稳定性考察

1.3.5.1 乌药醚内酯稳定性考察 精密称取同一批次乌药粉末，按照1.3.3.1项条件提取，1.3.1.1项色谱条件进样，分别在0、4、8、12、16、20、24h检测并记录各峰面积（mAU×min），计算7次进样峰面积的RSD值。

1.3.5.2 去甲异波尔定稳定性考察 精密称取同一批次乌药粉末，按照1.3.3.2项条件提取，1.3.1.2项色谱条件进样，分别在0、4、8、12、16、20、24h检测并记录各峰面积（mAU×min），计算7次进样峰面积的RSD值。

1.3.6 重复性考察

1.3.6.1 乌药醚内酯重复性考察 精密称取同一批次乌药样品6份，按照1.3.3.1项条件提取，1.3.1.1项色谱条件进样，记录各峰面积（mAU×min），计算含量及其RSD值。

1.3.6.2 去甲异波尔定重复性考察 精密称取同一批次乌药样品6份，按照1.3.3.2项条件提取，1.3.1.2项色谱条件进样，记录各峰面积（mAU×min），计算含量及其RSD值。

1.3.7 线性方程考察

1.3.7.1 乌药醚内酯线性方程考察 精密吸取原浓度的乌药醚内酯对照品溶液1、2、4、6、10mL至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别制成浓度为0.0144、0.0288、0.0576、0.0864、0.1440mg·mL-1的对照品溶液，准确吸取上述对照品溶液10μL，按1.3.1.1项色谱条件进行测定。以浓度为横坐标（x，单位mg·mL-1），峰面积为纵坐标（y，单位mAU×min），绘制标准曲线，得到回归方程。

1.3.7.2 去甲异波尔定线性方程考察 精密吸取原浓度去甲异波尔定对照品溶液1、2、4、5、10mL至10mL容量瓶中，加甲醇-盐酸（0.5→100）（2:1）至刻度，摇匀，超声至完全溶解，分别制成浓度为0.0220、0.0440、0.0880、0.1100、0.2200mg·mL-1的对照品溶液，准确吸取上述对照品溶液10μL，按1.3.1.2项色谱条件进行测定。 以浓度为横坐标（x，单位mg·mL-1），峰面积为纵坐标（y，单位mAU×min），绘制标准曲线，得到回归方程。

1.3.8 加样回收率考察

1.3.8.1 乌药醚内酯加样回收率考察 精密称取已知含量的天台乌药0.125g，加入一定量的乌药醚内酯对照品，按照1.3.3.1项的方法制备溶液，进样10μL，以1.3.1.1项色谱条件进行测定，测定峰面积，计算回收率，实验重复6次。

1.3.8.2 去甲异波尔定加样回收率考察 精密称取已知含量的天台乌药0.050g，加入一定量的去甲异波尔定对照品，按照1.3.3.2项的方法制备溶液，进样10μL，以1.3.1.2项色谱条件进行测定，测定峰面积，计算回收率，实验重复6次。

1.3.9 含量测定

1.3.9.1 乌药醚内酯含量测定 精密称取6个不同产地的乌药0.250g，分别按1.3.3.1项的方法制备供试品溶液，进样10μL，以1.3.1.1项色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，计算乌药醚内酯含量，重复2次。

1.3.9.2 去甲异波尔定含量测定 精密称取6个不同产地的乌药0.100g，分别按1.3.3.2项的方法制备供试品溶液，进样10μL，以1.3.1.2项色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，计算去甲异波尔定含量，重复2次。

1.4 不同产地乌药与天台乌药主成分含量差异比较 对比5个产地的乌药中的主成分乌药醚内酯、去甲异波尔定含量，分别按下式计算相对天台乌药的含量差异比。含量差异比（%）=（天台乌药主成分含量-其他产地乌药主成分含量）/天台乌药主成分含量×100%。

1.5 不同产地经纬度查询 通过百度网站查询，拾取坐标系统检索不同产地的经纬度。

1.6 显微观察性状特征 取6个不同产地的乌药，打粉过3号筛，取粉末适量，滴加甘油醋酸进行显微观察。

2 结果

2.1 精密度考察结果 计算得出，乌药醚内酯、去甲异波尔定RSD值分别为0.68%、0.03%，说明该测定方法的精密度良好。

2.2 稳定性考察结果 计算得出，乌药醚内酯、去甲异波尔定RSD值分别为0.36%、0.64%，说明样品至少在24h内稳定。

2.3 重复性考察结果 计算得出，乌药醚内酯、去甲异波尔定RSD值分别为0.52%、2.22%，说明该测定方法的稳定性良好。

2.4 线性方程考察结果 乌药醚内酯在0.0144～0.1440mg·mL-1浓度范围内线性拟合的标准曲线回归方程为y=906 471.4612x-1 150.7671（r2=1），去甲异波尔定在0.0220～0.2200mg·mL-1浓度范围内线性拟合的标准曲线回归方程为y=12 958 444.1900x+5 552.8778（r2=0.9997），说明该测定方法线性关系良好。

2.5 加样回收率考察结果 乌药醚内酯回收率RSD值为0.57%，加样回收率98.70%～100.30%；去甲异波尔定回收率RSD值为2.22%，加样回收率97.20%～103.90%，说明该方法的加样回收率符合要求。见表1、2。

表1 乌药醚内酯加样回收试验结果Tab.1 Determination results of the recovery rate of linderane

表2 去甲异波尔定加样回收试验结果Tab.2 Determination results of the recovery rate of norisoboldine

2.6 含量测定结果 计算得出6个不同产地乌药中乌药醚内酯、去甲异波尔定的含量，并换算成质量分数。见表3。浙江天台乌药中所含乌药醚内酯明显高于其他产地。各产地乌药醚内酯含量比例为浙江天台∶浙江衢州∶湖北恩施∶江西景德镇∶湖南怀化∶云南楚雄=67∶45∶40∶25∶20∶1， 去甲异波尔定含量比例为浙江天台:浙江衢州:湖北恩施:江西景德镇:湖南怀化:云南楚雄=62:75:84:65:59:1。

表3 不同产地乌药主要成分含量测定及地理分布Tab.3 Assay of main components and geographical distribution of Linderae Radix from different regions

2.7 不同产地乌药与天台乌药主成分含量差异比较 计算得出，其他产地相对天台产地的乌药醚内酯含量差异比，浙江衢州、湖北恩施、江西景德镇、湖南怀化、云南楚雄分别为32.80%、41.50%、62.70%、70.70%、98.50%；而其他产地相对天台产地的去甲异波尔定含量差异比，浙江衢州、湖北恩施、江西景德镇、湖南怀化、云南楚雄分别为22.00%、35.70%、4.90%、3.60%、98.40%。说明与天台比较，各产地所产乌药的去甲异波尔定含量相对接近，而乌药醚内酯含量差异比较大，适合作为不同产地品质的评价指标。

2.8 不同产地经纬度查询结果 浙江天台与浙江衢州、江西景德镇三个产地经度、纬度相近；湖北恩施与湖南怀化两者经度相近；云南楚雄与其他5个产地经度、纬度存在显著差异。见表3。

2.9 不同产地乌药性状特征显微观察 显微观察各个产地乌药粉末颗粒性状特征提示，浙江天台、浙江衢州、江西景德镇三者显微特征较相似，淀粉粒、油细胞常见，浙江天台、江西景德镇未见糊化淀粉粒；湖北恩施与湖南怀化两者显微特征较相似，均含有大量糊化淀粉粒，少量石细胞，较少的油细胞和淀粉粒，木纤维中淀粉粒较少；云南楚雄与其他5个产地乌药显微差异显著，其淀粉粒极多，多呈团簇状，木纤维中淀粉粒常见并且颗粒较大，油细胞较少。见表4及图1～7。

表4 不同产地乌药粉末显微性状特征Tab.4 Characteristics of microscopic properties of Linderae Radix powder from different regions

图1 不同产地乌药淀粉显微特征（40×）Fig.1 Microstructure of starch granules Linderae Radix from different regions

图2 不同产地乌药导管显微特征（40×）Fig.2 Microstructure of starch catheters of Linderae Radix from different regions

图3 不同产地乌药韧皮纤维显微特征（40×）Fig.3 Microstructure of bast fiber of Linderae Radix from different regions

图4 不同产地乌药木纤维显微特征（40×）Fig.4 Microstructure of wood fibers of Linderae Radix from different regions

图5 不同产地乌药油细胞显微特征（40×）Fig.5 Microstructure of eleocyte of Linderae Radix from different regions

图6 不同产地乌药石细胞显微特征（40×）Fig.6 Microstructure of sciereid of Linderae Radix from different regions

图7 不同产地乌药糊化淀粉粒显微特征（40×）Fig.7 Microstructure of Gelatinized starch granules of Linderae Radix from different regions

3 讨论

从主要成分含量检测结果看，本研究提示乌药地理分布与其“道地性”显著相关。浙江天台乌药中乌药醚内酯含量最高质量分数为0.34%，去甲异波尔定含量中等。浙江天台与浙江衢州、江西景德镇三个产地经度、纬度相近，三者主成分含量较相近，其中乌药醚内酯的含量随着经度减小而减少；湖北恩施与湖南怀化两者虽经度相近，但因为纬度差异，湖南怀化的乌药醚内酯含量仅为湖北恩施的一半；云南楚雄与其他5个产地经度、纬度差异均较明显，成分含量存在明显的差距。上述结果提示，产地的纬度、经度都能显著影响药物主成分的含量，产地经纬度与天台越接近，乌药醚内酯等主成分含量越道地。黄林芳等[9]对肉苁蓉进行了生态研究，发现不同经纬度肉苁蓉主成分含量存在明显差异，亦说明地理分布确实能影响药材的“道地性”。

从显微性状特征看，地理位置分布与乌药“道地性”亦存在显著相关性，产地经纬度与天台越接近，乌药显微特征越道地。浙江天台乌药淀粉粒、油细胞较多，木纤维中亦含有丰富的淀粉粒，但不含石细胞；浙江天台、浙江衢州、江西景德镇三个产地经度、纬度明显相近，三者显微特征皆较相似，其中淀粉粒个数随着经度减小而减少；湖北恩施与湖南怀化两者经度相近，显微特征比较相似，均含有大量糊化淀粉粒，少量石细胞，较少的油细胞和淀粉粒，且木纤维中淀粉粒较少；云南楚雄与其他5个产地经度、纬度相差较大，其所产乌药显微差异显著，其淀粉粒极多，多呈团簇状，木纤维中淀粉粒常见，而且颗粒较大，油细胞较少，偶见石细胞。王旭红等[10]研究认为乌药块根、直根中无石细胞；但笔者观察到了少量石细胞，与房志坚等[11]研究结论一致。综上所述，产地经纬度对药物显微特征的影响较大，经纬度相似的产地所产乌药的显微特征相近，经度越小淀粉粒越少，石细胞越多（云南楚雄除外）；另外，淀粉粒、糊化淀粉粒和石细胞可作为不同产地乌药药材的显微鉴别特征指标。

研究表明，气候相似是保障药材品质的基本条件[12]。经度、纬度不同直接导致太阳辐射和海陆分布不同，造成不同地段气候条件的主要因子——光照、温度、水分等的差异，形成了不同的纬度地带性和经度地带性气候环境，这可能是造成不同产地药材主成分含量与显微性状差异的关键原因，也是造成药材“道地性”的根本原因。本研究也证实，不同产地经纬度不同，所产乌药主成分含量不同，显微性状也存在显著差异；乌药品质差异与地理分布明显相关，天台特殊的气候条件造就了天台乌药独特的生理生化特征。

综上所述，本研究结果提示可将乌药醚内酯含量高，淀粉粒较多、油细胞较多，不含石细胞，作为道地乌药独特的综合性指标。另外，依据《中华人民共和国药典》规定的标准：乌药醚内酯不少于0.03%，去甲异波尔定不少于0.40%[6]，本研究中云南乌药所含乌药醚内酯为0.01%，去甲异波尔定为0.01%，不能应用于临床。